基于COⅠ基因的DNA条形码在鳖科动物鉴定上的应用

唐伟+朱治任+汪财生++张明兴++钱国英

摘要：为探讨DNA条形码在中华鳖不同地理群体鉴定上的可行性，以中华鳖COⅠ基因全长序列为对象设计通用引物，对中华鳖6个地理群体及鳖科不同属间进行了遗传多样性分析。结果发现，不同地理群体中华鳖的遗传距离在0.020 3～0.041 7之间，群体内平均遗传距离在0.011 3～0.033 8之间，种间与种内的遗传距离没有形成有效的条形码间隙，在基于个体遗传距离的NJ树上，各群体间的个体并没有形成有效的分支。在对鳖科不同属进行分析时发现属间及属内遗传距离形成了明显的差异间隙，在NJ树上，不同鳖按照属的特性分别进行聚类，并具有较高的节点支持率，聚类分析可信度高。因此，COⅠ基因作为DNA条形码，能够有效地用于区分鳖科动物的不同属，但不适用于中华鳖地理群体的分离鉴定。

关键词：DNA条形码；COⅠ基因；中华鳖；地理群体；鳖科

中图分类号： S932.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）06-0030-06

中华鳖（Pelodiscus sinensis）隶属于动物界（Animalia）脊索动物门（Chordata）脊索动物亚门（Vertebrata）爬行纲（Repitlia）龟鳖目（Chelonia）曲颈龟亚目（Cryotodira）鳖总科（Trionychoidea）鳖科（Trionychidae）中华鳖属（Pelodiscus），又称甲鱼、水鱼、王八等，主要生活在淡水水域，为水陆两栖型动物。中华鳖地理分布非常广泛，在我国主要分布于长江及黄河流域等，国外主要分布于越南、日本和朝鲜等地[1]。一般认为，中华鳖无明显的亚种分化，但是存在很多地理变异，如黄河流域的黄河群体、浙江省宁波市姚江流域的姚江群体等。我国因地域辽阔，南北纬度差异大，各地域的生态条件不尽相同，所以，中华鳖在不同的地域所形成的基本形态也不尽相同，部分鳖经过人工的定向选育甚至还形成了新的品系，如清溪乌鳖。为保证中华鳖养殖业的稳定、健康和持续发展，进行良种选育以改善中华鳖苗种的质量极为重要，同时，通过有效的方法对不同地域中华鳖的种质进行鉴定和评价具有非常长远的意义。目前，DNA条形码作为一种成熟的mtDNA分子标记，已被广泛应用于物种的鉴定，在龟鳖类[2-6]、鱼类[7-9]、鸟类[10-11]、昆虫类[12]、及甲壳动物[13]等物种上均有相关报道，但在中华鳖不同地理群体的研究上，尚未见报道。

DNA条形码是Hebert等于2003年利用线粒体细胞色素C氧化酶I亚基（cytochrome C oxidase subunit I，CO I）构建物种鉴别体系时首次提出的，利用一段短的基因序列作标记对物种进行快速鉴定，并以此建立生物物种的個体与DNA序列一一对应的关系[14]。Hebert等比较分析了动物界9个门中13 320个同属不同物种的COⅠ基因序列，发现种内的差异基本上小于1%，种间的差异一般大于11.3%。因此，Hebert提出，应用COⅠ基因作为条形码进行物种鉴定时，种间遗传距离应为种内遗传距离的10倍及以上，种间遗传距离以2%为界[15]。

本研究通过对中华鳖6个地理群体的111个个体线粒体COⅠ基因序列进行比对分析，探讨COⅠ基因在中华鳖各群体间及群体内的序列变异，并构建系统进化树，进而检验COⅠ基因作DNA条形码在中华鳖群体鉴定上的有效性，以期为中华鳖地理群体的鉴定提供依据。同时，下载了鳖科不同属的其他鳖类的COⅠ基因序列，进行综合比对，探讨DNA条形码在鳖科属间鉴定的可行性。

1材料与方法

1.1试验材料

试验采集了不同地理群体的中华鳖（其中，姚江群体编号为Y1～Y34，日本群体编号为R1～R21，太湖群体编号为T1～T17，黄河群体编号为HH1～HH6，清溪乌鳖编号为 W1～W4和W6～W19，清溪花鳖编号为h1～h15），并结合从NCBI上下载的相关鳖科动物COⅠ基因序列一起进行分析（表1）。其中，印度鳖属的恒河鳖（Nilssonia gangeticus）、印度孔雀鳖（Nilssonia hurum）及黑鳖（Nilssonia nigricans）的拉丁名与蓝色动物学网（http：//www.blueanimalbio.com/reptile/gui/bie.htm）的命名有异，此处不做更正，均以下载序列的命名为准。

1.2总DNA的提取

中华鳖解剖前先置于0.05%的高锰酸钾溶液中浸泡 10 min 杀菌后，颈部放血处死，按常规解剖步骤，迅速取前腿肌肉，用液氮研磨成粉末。称取25～30 mg研磨后的粉末，装于1.5 mL灭菌离心管中，按样品信息编号，液氮速冻后于 -80 ℃ 保存。采用OMEGA公司的Tissue DNA Kit试剂盒提取中华鳖总DNA（详见说明书）。用1.5%的琼脂糖电泳检测DNA提取的质量，并用分光光度计检测其吸光度及浓度后，将符合要求的DNA溶液稀释成约30 ng/μL，待用。

1.3PCR扩增和测序

采用Primer Premier 6.0结合Oligo 7软件，以中华鳖线粒体COⅠ基因全长序列为对象，设计通用引物RC122-F（5′-CCAGTGACTTTAACCCGTTGAT-3′）和RC122-R（5′-GAGAAAGAAACATGAAGGTCATGTG-3′），均由华大基因合成。

PCR反应采用50 μL体系，包括25 μL康为PCR Mix，2 μL RC122-F（10 μmol/L），2 μL RC122-R（10 μmol/L），17 μL ddH2O，4 μL DNA模板。PCR反应程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，33个循环；72 ℃ 7 min。扩增完成后，将PCR产物全部吸入到1×TBE缓冲液配制的1.5%琼脂糖凝胶点样孔，用100 V恒压电泳检测，确认为所需目的条带，进行割胶及目的条带回收，低温保存送至华大基因进行双向测序。测序所用引物与PCR引物相同。

1.4数据分析

采用Lasergene v5.0软件[16]中的SeqMan工具及CExpress软件，根据测序结果中的峰值，对测得的序列进行人工拼接。利用Clustal X 1.85软件[17]对测序所得序列进行排列比对，并辅助以人工校正；用DNAsp 5.1软件计算各群体的单倍型数、多态位点数、单倍型多样性指数（Hd）、核苷酸多样性指数（Pi）、平均核苷酸差异数（K）等参数；运用DAMBE软件[18]，以TN93模型校正距离为横坐标，转换和颠换數为纵坐标，做散点分布图，判断其散点变化趋势；将所有序列输入到MEGA 6.0软件中进行比对[19]，计算各群体的碱基含量比、碱基转换及碱基颠换等参数，采用Kimura 2-parameter（K2p）模型计算其遗传距离，并采用Neighbour-Joining（NJ）法构建系统进化树。

2结果与分析

2.1中华鳖COⅠ基因的序列测定

采用自主设计的通用引物RC122-F、RC122-R，分别对不同地理群体中华鳖的DNA样品进行扩增后测序，所得序列确定为COⅠ基因片段后，采用Clustal X及MEGA软件进行排比核对，截取同源长度的序列为1 534 bp的片段（图1）。由图1可知，扩增目的条带清晰、整齐，无其他非特异性杂带存在，并且测序时采用双向测序程序，保证了测序结果的准确性。

2.2基于CO1基因对中华鳖不同地理群体的遗传多样性分析

将截取排比后同源长度相同的序列输入到MEGA 6.0软件中，以中华鳖COⅠ基因全长序列作参考，比对后发现，中华鳖COⅠ基因分为2个变异区间，靠近5′端400～700 bp区域为主要的变异区间，大部分变异位点都集中于此，此区域内的保守位点相对较少；靠近3′端850～1 250 bp区域范围内，依稀存在部分变异位点，同时也包含大量保守位点区域。从 1 534 bp 的序列中，共检测到928个保守位点（conserved sites，C）、337个简约信息位点（parsimony-in formative sites，Pi）、606个变异位点（variable sites，V）、269个自裔位点（singleton site，S），分别占整个序列的60.50%、39.50%、21.97%、17.54%。统计碱基的组成发现，各碱基平均含量为A=30.10%、T=30.27%、C=23.41%、G=16.22%，其中 A+T的含量（60.37%）明显高于C+G的含量（39.63%），表现出明显的线粒体基因A+T碱基偏好性。各群体间的碱基平均含量差异不大，其中碱基A、T的含量相当，G的含量最少。A+T的含量在3个密码子位点中的含量均高于G+C的含量，其中以密码子第3位点的含量最高，达70.2%。

运用DNAsp 5.1软件分析不同群体中华鳖遗传多样性参数，结果（表2）显示，112个不同地理群体的中华鳖个体中，共检出了133个单倍型，其中姚江群体的最多，达41个，黄河群体仅8个。视6个地理群体中华鳖为一个总群体，则总群体的单倍型多样性指数（Hd）为0.973，碱基多样性指数（Pi）为0.017 1，平均核苷酸差异数（K）为26.314。姚江群体的单倍型多样性显示出最高水平，太湖群体和日本群体在单倍型多样性（Hd）、碱基多样性指数（Pi）及平均核苷酸差异数（K）上总体显示出较为突出的遗传多样性，而黄河群体和清溪乌鳖则显示出较为贫乏的核苷酸多样性。

采用MEGA 6.0软件，基于Kimura-2-parameter（K2p）模型计算中华鳖不同地理群体间的遗传距离，结果（表3）显示，中华鳖不同地理群体间的遗传距离在0.020 3～0.041 7之间，其中遗传距离最大的为日本群体与清溪乌鳖，最小的为日本群体与黄河群体。姚江群体与其他群体间的遗传距离均大于0.02。种内遗传距离在0.011 3～0.033 8之间，从大到小的顺序依次为清溪花鳖>清溪乌鳖>太湖群体>日本群体>姚江群体>黄河群体。

根据表3中中华鳖不同地理群体间的遗传距离，用MEGA 6.0中的NJ程序，构建基于群体间遗传距离的系统进化树（图2），显示黄河群体与日本群体最先聚为一支，然后再与姚江群体聚类，接着依次分别与清溪花鳖、太湖群体及清溪乌鳖聚类。姚江群体与黄河群体、日本群体有相对较近的亲缘关系，各群体中，黄河群体与日本群体间的亲缘关系最近。

根据不同个体COⅠ基因序列信息，采用MEGA 6.0软件基于Kimura-2-parameter（K2p）模型构建分子进化树（图3），由进化树可知，中华鳖各群体的个体散乱地聚于不同的分支，聚类不具有种的特性。

2.3基于COⅠ基因对鳖科动物不同属间的遗传多样性分析

本研究从NCBI上下载了与中华鳖同源性相近的其他鳖科动物的COⅠ基因序列（表1），用ClustalX1.85软件进行

人工排比后，保留共有序列，最后所得片段长度为650 bp。应用MEGA 6.0软件进行比对分析，结果显示，整个鳖科动物COⅠ基因碱基A、T、C、G的平均含量分别为29.3%、293%、25.2%、16.3%，A+T含量（58.6%）高于C+G的含量（41.5%），所有鳖科动物中，核苷酸G的含量均较低，低于18%。统计各位点碱基使用情况，A-T碱基在第2位密码子的使用量最高，为73.1%，而C-G碱基在第3位密码子的使用量最高，为50.4%，甚至超过了A+T的含量，表现出明显的碱基偏倚。

用MEGA 6.0软件，基于Kimura-2-parameter模型计算不同鳖科动物间的遗传距离，发现鳖科动物各种间的遗传距离在0.013 1～0.268 8之间，其中以黄河鳖与小鳖间的遗传距离最小，为0.013 1，而努比亚缘板鳖（Cyclanorbis elegans）与清溪乌鳖间的遗传距离最大，达0.268 8。中华鳖不同群体相互间的遗传距离在0.013 1～0.048 3之间，均低于0.050。与中华鳖属遗传距离相对较近的为我国南方特有品种——砂鳖（Trionyx axenaria），其与中华鳖各地理群体的遗传距离在0.048 7～0.066 9之间。

利用MEGA 6.0软件中的Tamura 3-parameter mode（T92）+Gamma Distributed（G）的组合模型进行计算，采用NJ法构建系统进化树（图4），以1 000次自展分支检验（Bootstraps test）可靠性。由图4可知，不同鳖科动物按照其属的特性相互聚类，其中，中华鳖属（Pelodiscus）的7个地理群体（姚江群体、清溪乌鳖、清溪花鳖、太湖群体、日本群体、黄河群体及小鳖）相互聚为一个大支，节点支持率为97%；鳖属（Trionyx）的砂鱉（Trionyx axenaria）独自占有一支，并与中华鳖属的分支聚在一起，节点支持率为99%；山瑞鳖属（Palea）的山瑞鳖（Palea steindachneri）独自占有一支；印度鳖属（Aspideretes）印度孔雀鳖（Nilssonia hurum）及黑鳖（Nilssonia nigricans）相互聚类，节点支持率为96%，并与缅甸孔雀鳖属 （Nilssonia）的缅甸孔雀鳖（Nilssonia formosa）汇聚，然后再与恒河鳖（Nilssonia gangeticus）聚类，节点支持率为95%，提示印度鳖属可能与缅甸孔雀鳖属同系。亚洲鳖属（Amyda）的中南半岛大鳖（Amyda cartilaginea）独为一支；斑鳖属（Rafetus）的幼河斑鳖（Rafetus euphraticus）和斑鳖（斯氏鳖）（Rafetus swinhoei）相互聚为一支，节点支持率为92%；缘板鳖属（Lissemys）的印度箱鳖（Lissemys punctata）和缅甸箱鳖（Lissemys scutata）相互聚为一支，节点支持率为95%；盘鳖属（Cyclanorbis）的努比亚盘鳖（Cyclanorbis elegans）和塞内加尔盘鳖（Cyclanorbis senegalensis）相互聚类，并与圆鳖属（Cycloderma）的赞比亚圆鳖（Cycloderma frenatum）聚为一个大支。缘板鳖属、盘鳖属及圆鳖属3个属共同聚为一个大支，节点支持率为99%，提示这3个属间亲缘关系较近。

3讨论

3.1基于COⅠ基因对不同地理群体中华鳖的遗传差异性分析

6个中华鳖地理群体中COⅠ基因序列的A、T、C、G碱基平均含量为30.10%、30.27%、23.41%、16.22%，其中以碱基G的含量最低，这是线粒体DNA的一个显著特点[20]，A+T的含量（60.37%）明显高于C+G的含量（39.63%），表现出明显的线粒体碱基偏好性。密码子各位点的A+T含量均高于G+C的含量，其中以第3位点的含量最高，达70.2%。Desalle等指出，DNA进化过程中，近缘物种间DNA编码区序列因较多发生同义突变，序列中转换发生的频率一般较颠换高[21]。本研究中的转换/颠换比为1.4，表明COⅠ基因序列的突变没有达到饱和，可以进行系统发育树的构建分析。

视6个地理群体中华鳖为一个总群体，则总群体的单倍型多样性指数为0.973，碱基多样性指数为0.017 1。Grant等认为，当单倍型多样性>0.5，核苷酸多样性>0.005时，则该物种具有相对较高的遗传多样性[22]。由此可以看出，本研究中的6个不同地理群体的中华鳖均具有较高的遗传多样性，这为我国中华鳖种质资源的保护奠定了基础。

在种群遗传距离分析上，杜启艳等认为，物种在科、属、种3个水平上遗传距离的差别若小于2%，则可确定为同一物种[23]。本研究中，6个不同地理群体中华鳖间的遗传距离在2.03%～4.17%之间，种间平均遗传距离为2.58%，各群体间的遗传距离均大于2%，其中黄河群体与日本群体间的遗传距离（2.03%）最小。Anderson指出，物种在长期地理分隔以后，再发生杂交行为，可能会产生渐渗杂交的现象，从而降低物种的种间遗传距离[24]。日本群体中华鳖是早年从我国引种过去，经过长期的性状改良，再从日本引入我国的一个地理群体，作为一个改良后的新品系，备受养殖户及消费者的喜爱，其养殖面积及区域也日益扩增，在养殖过程中难免存在与其他中华鳖群体杂交的情况，产生渐渗杂交的现象，从而造成其与黄河群体或其他群体间的遗传距离相对较小。因此，按照杜启艳等的标准[23]，本研究中的6个地理群体中华鳖均达到了种的分化水平。

3.2COⅠ基因作为DNA条形码在鳖类鉴定中的有效性分析

COⅠ基因是线粒体基因组中常用的作为DNA条形码的标记基因[25]，其5′端区域的一段序列既包含有大量的保守区以进行通用引物的扩增，又包含有效的变异区可进行不同物种的区分，并且在大多数动物中，COⅠ基因都存在显著的基因变异，因此，动物界中的物种鉴定通常选择COⅠ基因来作为DNA条形码[7，14，26]。Hebert等提出，利用线粒体COⅠ基因作DNA条形码对不同物种进行鉴定时，最关键的是种群的种间遗传距离必须大于种内遗传距离，并且差距在10倍及以上，其中种间的遗传距离以2%为界[15]。

本研究对中华鳖不同地理群体进行遗传差异性分析时发现，种间遗传距离在0.020 3～0.041 7之间，均已达到2%以上种的分化水平，种内平均遗传距离在0.011 3～0.033 8之间，种间与种内的遗传距离并没有形成10倍的有效差异，相反，个别群体中，种内的平均遗传距离甚至大于种间，如清溪花鳖及日本群体。在基于个体COⅠ基因差异的NJ进化树上，相同群体的不同个体并没有按照种的特性进行聚类，而是零散地聚于各个分支，个别个体甚至单独成支。这可能与近缘物种的杂交有关。传统分类法通过斑点、体色等外部特征将中华鳖的不同地理群体区分开来。而中华鳖因相似的生活环境，缺乏有效的隔离机制，特别是近些年来，大量的引种、倒种及种间杂交，以期培育出优良性状（生长性能及表型性能）的品种，致使中华鳖不同群体间杂交紊乱，使得群体间基因的渗透概率较高。mtDNA呈母系遗传，杂交子代的mtDNA几乎全都来自母本，而控制物种表型性状的基因可能来源于核DNA。因此，基于COⅠ基因作DNA条形码对近缘杂交地理群体的鉴定可能存在一定程度的缺陷，需要结合核DNA的相关鉴定才能得到比较真实可靠的结果。根据种间与种内遗传距离差异度及进化树分析，本研究认为，COⅠ 基因不能将中华鳖的不同地理群体鉴定开来。

在对鳖科不同属间的遗传差异性分析时发现，属间遗传距离在0.063 9～0.244 6之间，属内平均遗传距离在 0.038 5～0.136 7之间[27]，属间与属内之间形成了明显的差异空隙，非常适用于DNA条形码的鉴别。在鳖科不同属的NJ进化树上，不同鳖按照属的特性分别进行聚类，并具有较高的节点支持率，聚类分析可信度高。因此，本研究认为，COⅠ基因作为DNA条形码，能够有效地用于鳖科不同属间的鉴定。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.007