湖北十堰地区女性宫颈人乳头状瘤病毒感染与亚型分布

魏英+李婷婷+邓志纬+刘贝贝+李斌

[摘要] 目的 研究湖北十堰地區女性宫颈脱落细胞人乳头状瘤病毒（HPV）感染和亚型分布情况。 方法 收集2015年12月～2016年12月在湖北医药学院附属东风医院接受HPV检测的8543名女性为研究对象，采用PCR基因扩增和免疫杂交技术，进行21种HPV亚型的基因分型检测。 结果 总样本数8543例，共检查HPV阳性标本783例（高危604例，低危179例），感染率为9.17%；其中，单一亚型感染718例，占91.70%，多重感染65例，占8.30%；前五位单一高危险型分别为52型（114例）、16型（86例）、58型（84例）、53型（60例）、39型（40例），其阳性率分别为14.56%、10.98%、10.73%、7.66%、5.11%。≥55岁年龄组感染率最高为17.07%，<25岁年龄组阳性率为15.46%，25～<35岁年龄组感染率为9.20%，35～<45岁和45～<55岁年龄组感染率分别为7.76%和9.90%。 结论 湖北十堰地区女性HPV感染率较居中，以单一高危感染为主，HPV52、16、58型为前三大常见感染亚型，且各年龄段HPV感染率构成比呈现“U”型走势。

[关键词] 人乳头状瘤病毒；感染率；基因分型；年龄

[中图分类号] R711 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）03（c）-0107-04

HPV infection in cervix and genotype distribution of women in Shiyan of Hubei

WEI Ying1 LI Tingting2 DENG Zhiwei2 LIU Beibei2 LI Bin3

1.Experiment Center， Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China； 2.The Second Clinical College， Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China； 3. Department of Gynaecology and Obstetrics， Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China

[Abstract] Objective To investigate the infection and genotype distribution of human papilloma virus （HPV） in female cervical exfoliative cells in Shiyan， Hubei province. Methods Samples of cervical exfoliated cells were collected from 8543 female in Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine from December 2015 to December 2016 as study objects. Twenty-one HPV subtypes were examined by PCR gene amplification and immune hybrid technology. Results In the total sample of 8543， HPV positive was detected in 783 cases （604 cases of high risk HPV， and 179 cases of low risk HPV）， total infection rate of HPV was 9.17%. Among these positive samples， the single-subtype infection rate was 91.70% （718 cases）， and the multiple-subtype infection rate was 8.30% （65 cases）. HPV-52 （114 cases， 14.56%）， HPV-16 （86 cases， 10.98%）， HPV-58 （84 cases， 10.73%）， HPV-53 （60 cases， 7.66%） and HPV-39 （40 cases， 5.11%） were the top five prevalent subtypes. The highest HPV positive rate （17.07%） was found in older than 55 years age group. The rate of younger than 25 group was 15.46%， the rates of 25-<35 years， 35-<45 years and 45-<55 years age group was 9.20%， 7.76% and 9.90% respectively. Conclusion The female HPV infection rate in Shiyan Area is median， and the single and high-risk subtype infection accounts for a considerable proportion. HPV-52， HPV-16 and HPV-58 are the top three prevalent subtypes， and the distribution of HPV infection rate in each age group presented "U" shaped trend.

[Key words] Human papilloma virus； Infection rate； Genotype； Age

宫颈癌是全球女性癌症相关死亡的主要原因，全球每年有530 000例新发病例和275 000例死亡病例[1]。宫颈癌是全球第三大常见的癌症，但在发达国家是第六个最常见的癌症，而在资源有限的国家却是第二个最常见的癌症[2]。在中国，宫颈癌的发病率每年增加2%～3%，每年大约有135 000例宫颈癌新发病例，且每年大约有50 000名女性死于宫颈癌[3-4]。

宫颈癌有较长的癌前病变期，通过全民筛查和组织病理学检测，可有效降低宫颈癌的发病率。人乳头状瘤病毒（HPV）检测是宫颈癌筛查的重要手段，流行病学研究显示，HPV感染是宫颈癌和癌前病变的主要原因[5]。HPV基因组有8000对碱基，呈球形，无包膜，是超螺旋双链环状DNA病毒。在人和动物中分布广泛，具有高度的种属特异性。到目前为止，已鉴定出超过100种HPV基因型，有54种可以感染生殖道黏膜[6]。根据感染生殖道黏膜HPV菌株的致癌性显著不同将其分为低危型和高危型[7]，高危型HPV的持续感染与宫颈癌密切相关。已经证明，几乎所有类型的宫颈癌（鳞状细胞癌、腺鳞癌和腺癌）都与高危型HPV感染有关。根据流行病学和分子生物学报告，至少有15中HPV基因型已经确认为宫颈癌的高危因素（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68）[8]。因此，HPV感染的检测，特别是高危HPV感染的检测，已经成为预防宫颈癌发生、发展的一个关键问题。

HPV感染率及基因型的分布，特别是高危型基因的分布，在不同国家和地区显示出多样性，在中国各省市也大大不同，这种地区的多样性对未来针对特定地区人群设计有效预防HPV疫苗至关重要。湖北十堰地区地理位置独特，卫生健康条件相对匮乏，尚无有关HPV感染流行病学调查的报告。这项研究针对该地区8543例女性宫颈脱落细胞进行了HPV的感染率和基因型分布的初步分析，发现了该地区HPV感染的特点，为该地区宫颈癌筛查和疫苗的预防战略提供了理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年12月～2016年12月在湖北医药学院附属东风医院进行HPV检测的8543名女性。所纳入的对象均签署知情同意书自愿参加本研究调查。

1.2 仪器与试剂

核酸提取液试剂盒、HPV分型检测PCR试剂盒和HPV分型检测杂交试剂盒均购自凯普生物科技有限公司；PCR扩增仪器（美国Applied Biosystems公司）；自动杂交仪器（凯普生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 患者均处于非月经期，采集样本前1 d无性生活，且检测前3 d无阴道用药。样本采集由专业妇科医生负责，先用无菌棉拭子擦拭宫颈口可见的分泌物，再将宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转5圈，刷取宫颈脱落细胞，放入加有专用细胞保存液的取样管中保存。样本采集后立即送检。4℃保存不超过24 h，标本运送时采用低温保存运送。

1.3.2 DNA分离提取与PCR扩增 取保存有宫颈细胞的细胞保存液1.0 mL，以14 000 r/min离心1 min，弃去上清液，用核酸提取试剂盒提取DNA。取2 μL DNA提取液，加入PCR扩增体系，反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃延伸5 min。PCR扩增的产物90 ℃变性10 min，立即取出冰浴5 min。

1.3.3 PCR产物杂交 按照试剂的说明书及仪器操作数进行操作。已变性DNA样品溶液加入0.3 mL预热至45℃的杂交液，开启自动杂交程序。杂交完毕用镊子取出杂交膜放在吸水纸上，1 h内分析结果。

1.3.4 结果判定 检测结果阳性点为清晰可见的蓝紫色圆点；根据膜条HPV分型分布图，判断阳性点为何种类型HPV；Biotin对照点，反映酶与显色底物反应，在检测中应为阳性。内对照点（IC）为质控模板DNA探针，若扩增反应体系中没有抑制因素，IC点出现；以上两对照点为阳性，其他点为阴性，应判定该样本检测结果为阴性，如果有一个HPV分型点为阳性，代表该样本为单一HPV感染，一个以上分型点为阳性代表该样本为多重HPV感染。

1.4 观察指标

统计患者HPV感染的情况以及不同亚型检出率的分布情况，比较不同年龄组HPV的感染率及不同基因型的分布情况。

2 结果

2.1 HPV感染的总体情况

在接受HPV检测的8543名患者中，一共检出783例HPV阳性病例，阳性率为9.17%；其中高危604例，低危179例。前五位单一高危险型分别为HPV52型（114例）、HPV16型（86例）、HPV58型（84例）、HPV53型（60例）、HPV39型（40例），其阳性率分别为14.56%、10.98%、10.73%、7.66%、5.11%。见表1。

2.2 各年龄段患者HPV检出率

<25岁年龄组阳性率为15.46%，25～<35岁年龄组感染率为9.20%，35～<45岁年龄组感染率为7.76%，45～<55岁年龄组感染率为9.90%，≥55岁年龄组感染率为17.07%。见表2。

2.3 HPV感染情况

在检测的8488例样本中，既有单一型HPV感染，也有两种及以上基因型的混合感染，样本的阳性例数为783例，其中单重阳性数为718例，单重阳性率为91.70%，多重阳性数为65例，多重阳性率為8.30%。见表3。

表3 HPV单一和多重感染阳性率

3 讨论

随着分子流行病学的发展，研究发现，宫颈癌的发病主要与HPV感染有关，43%～53%的宫颈上皮内瘤样病变患者存在HPV感染，约有90%的宫颈癌患者存在HPV感染[9]。HPV是一种属于乳多孔病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，无包膜，呈球形，病毒基因组是超螺旋双链环状DNA，能引起人体黏膜皮肤的鳞状上皮增殖。HPV是女性阴道中较常见的病原体，正常情况下其感染时间短暂，依靠阴道黏膜的自净能力很快消失。如果HPV在阴道中长期持续感染，则会导致宫颈上皮的异常增生与癌变。HPV感染属于性传播疾病，性活跃期妇女普遍易感，我国每年宫颈癌的发病率按照2%～3%的速度持续增高[10]。

根据HPV致病因素分为高危型和低危型。HPV基因型的分布，特别是高危型基因的分布，在不同地区显示出多样性，这种地区的多样性对未来针对特定地区人群设计有效预防HPV疫苗至關重要。在西方国家，HPV16和HPV18是两个主要的基因型，与70%的侵袭性宫颈癌相关[11]。而在中国，一些HPV流行病学数据表明，HPV感染基因型存在明显的地区差别[12-13]。李霓等[14]在对我国妇女HPV感染的多中心横断面研究中发现，感染率最高的为HPV16型，HPV58型位居第二，HPV52位列第三。在该研究查出十堰地区783例HPV感染病例，共发现15种高危HPV基因型，其中前五大基因型为HPV52（14.56%）、HPV16型（10.98%）、HPV58型（10.73%）、HPV53型（7.66%）、HPV39型（5.11%）。这与李霓等[14]报道的HPV感染多中心横断面研究存在一定的差异，但排前三位的基因型是一样的，此差异的存在尚需进一步的研究。

年龄是HPV感染的一个最重要的危险因素[15]。类似于先前的报道[16]，本研究中十堰地区HPV感染率与年龄也呈现“U”型曲线。如表2所示，HPV感染的阳性率在年龄≥55岁组中最高（17.07%），其次是年龄<25岁组（15.46%）。出现“U”型分布的原因可能为年轻女性有更频繁的性接触[17]；绝经期卵巢功能下降造成激素的明显波动，再加上衰老导致免疫功能下降，消除和抑制病毒的能力减弱，这些因素增加了HPV持续感染的易感性，且容易形成多重感染[18]。因此，本研究结果提示，湖北十堰地区应该更多地关注年龄<25岁和≥55岁女性的HPV基因分型和宫颈癌的筛查。

女性一生中可能反复感染HPV，也可存在多重感染。HPV的持续感染与宫颈癌的发病关系密切，控制HPV的持续感染是预防宫颈癌的重要措施。最近的研究表明，HPV多重感染形成的癌症比单重感染在治疗中更具有耐药性，HPV多重感染的宫颈癌患者治疗失败率是HPV单重感染的5倍[19]。但HPV多重感染在宫颈癌发生、发展中所扮演的角色仍是一个比较难的考察区域，目前尚不清楚是否有两种HPV基因型存在更多或者更少合并感染的机会。研究表明，HPV多重感染发生宫颈癌癌前病变或侵袭性癌症的风险并没有比HPV单纯感染高；而另一些研究表明，HPV多重感染似乎对宫颈癌的发生、发展具有协同作用[20-21]。本研究8488例样本中，多重感染率较低，仅65例。应该注意的是，本研究存在一定的局限性，研究中使用的HPV试剂盒只可以检测已知的HPV基因型中的21种类型；因此，多重感染的患病率可能在某种程度上被低估。此外，有关该地区HPV感染率与宫颈癌癌前病变或侵袭性癌症的发病率间的关系尚需进一步研究。

总之，十堰地区总共发现15个HPV高危基因型，以单一高危感染为多见，HPV52、16、58、53、39为前五个基因型；<25岁和≥55岁两个年龄组HPV感染率最高，构成比呈现“U”型走势。

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（收稿日期：2016-12-09 本文编辑：李亚聪）