知母总皂苷对血管性抑郁小鼠抑郁行为和脑组织病理学的影响

龚 林，邱 彦，刘 静，鲁 毅，王亚威，段 靖，马 静，周 永

（1.解放军454医院门诊部，江苏 南京210002；2.解放军454医院药剂科，江苏 南京 210002；3.解放军454医院器械科，江苏 南京 210002）

知母总皂苷对血管性抑郁小鼠抑郁行为和脑组织病理学的影响

龚 林1，邱 彦2，刘 静2，鲁 毅2，王亚威2，段 靖2，马 静2，周 永3

（1.解放军454医院门诊部，江苏 南京210002；2.解放军454医院药剂科，江苏 南京 210002；3.解放军454医院器械科，江苏 南京 210002）

目的：探讨知母总皂苷对血管性抑郁小鼠抑郁行为、脑组织炎症因子及病理学的影响。方法：采用反复缺血再灌注方法制备血管性抑郁小鼠模型，灌胃给予知母总皂苷，实验2周后，观察血管性抑郁小鼠行为学变化，检测小鼠脑组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量以及脑组织病理学改变。结果：与模型组相比，知母总皂苷中剂量组和高剂量组小鼠水平运动得分、垂直运动得分均明显增加（P ＜ 0.05），明显缩短小鼠悬尾、游泳不动时间（P ＜ 0.05）；与模型组比较，知母总皂苷三个剂量组均显著抑制小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的升高（P ＜ 0.05）。脑组织病理切片显示，与模型组相比，知母总皂苷各剂量组可显著减轻大脑皮质锥体细胞和脑实质神经细胞出现的核固缩、核溶解、核体不规则等情况。透射电镜结果显示，与模型组比较，知母总皂苷各剂量组能改善脑组织神经元细胞变小、突触泡扩张、血管周围有空白区等现象。结论：知母总皂苷对血管性抑郁小鼠具有显著的治疗作用。

知母总皂苷；血管性抑郁；行为学；炎症因子；病理学

血管性抑郁是抑郁常见的一种亚型，是与脑血管病或血管危险因素密切相关的一种老年期抑郁综合征。心脑血管疾病是一种严重威胁人类特别是中老年人健康的常见病，发病率逐年在增加；心脑血管疾病与抑郁互为因果致病，显著增加了患者的患病率、致残率和死亡率，但至今对血管性抑郁的病因及机制尚不完全明确。目前，我国人口老龄化发展速度极快，而血管性抑郁则是老龄化社会面临的一个重要的医学和社会问题。由于血管性抑郁患者对抗抑郁剂敏感性低（疗效不足50%），耐受性差，易出现毒副作用[1]，对患者及其家庭、社会造成沉重负担，已成为国内外医学关注的热点。知母主要功效为清热泻火、滋阴润燥、止渴除烦等，用于温热病、肺热咳嗽、阴虚火旺、高热烦渴等病症。研究[2]表明，知母皂苷及其苷元是知母的主要活性成分，具有防止老年痴呆，保护脑缺血损伤、抗凝血、抗氧化、抗肿瘤、抗骨质疏松、降糖降压、降血脂等广泛的药理活性；但未见知母活性成分或其中药复方在血管性抑郁方面应用与研究的报道。本实验通过阻断小鼠双侧颈总动脉反复缺血再灌注方法制备血管性抑郁模型，观察知母总皂苷（saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge.，SAaB）对血管性抑郁小鼠行为学的影响，脑组织中促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量的变化以及脑组织病理学改变，为其在抗血管性抑郁方面的开发利用提供科学依据。

1 材料

1.1 实验动物

ICR小鼠，60只，雄性，体质量18 ～ 20 g，SPF级，实验动物许可证号：SCXK（沪）2013-0016，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。动物实验室温度22 ～ 24 ℃，湿度40% ～ 60%，光照时间随自然变化，动物自由饮食。

1.2 药品及试剂

知母总皂苷（由解放军四五四医院药剂科提取制备），其主要成分为知母皂苷B-Ⅱ（52%），知母皂苷A-Ⅲ（7%），知母皂苷B（2%）；盐酸氟西汀胶囊（百优解，礼来苏州制药有限公司，批号：9901C）。TNF-α（批号：20151110）、IL-1β（批号：20151016）、IL-6（批号：20160108）ELISA试剂盒，均购自上海星黍生物科技有限公司。

1.3 实验仪器

酶标仪（Thermo FisherMK3型，上海赛默生物科技发展有限公司）；滑动切片机（RM2135型，德国LEICA公司）；光学显微镜（Olympus DM750型，日本Olympus公司）；透射电镜（H-600型，日本日立公司）。

2 方法

2.1 分组及给药

将60只小鼠随机分为6组，每组10只，分别为：假手术组、模型组、盐酸氟西汀组（10 mg・kg-1，按0.1 mL・10 g-1小鼠体质量灌胃给药）、低剂量组（知母总皂苷70 mg・kg-1）、中剂量组（知母总皂苷140 mg・kg-1）、高剂量组（知母总皂苷280 mg・kg-1）。知母总皂苷各剂量组按0.1 mL・10 g-1小鼠体质量灌胃给药。假手术和模型组灌胃给予相应体积的生理盐水。在实验造模前给药1周，造模后再继续给药1周，共给药14 d，qd。

2.2 血管性抑郁小鼠模型的建立[3]

小鼠经腹腔注射0.3%戊巴比妥钠麻醉后，将小鼠仰卧位固定，沿颈前正中切口，钝性分离暴露双侧颈总动脉，使用小号动脉夹阻断双侧颈总动脉供血5 min后，打开动脉夹恢复供血10 min，再次用动脉夹阻断供血5 min后，将动脉夹完全移开，使得其动脉恢复血流，术中密切观察小鼠呼吸、心跳，术后缝合切口。假手术组除不阻断供血外，其余处理方式与实验组相同。手术后用电热毯维持小鼠正常的体温，直到小鼠苏醒。于手术后7 d进行检查测试。

2.3 行为学检测[4-5]

2.3.1 旷场试验 旷场为一50 cm×50 cm×50 cm正方体，底面含25个等边方格。将小鼠放在中心方格内，观察3 min内的水平运动和垂直运动得分。两只动物实验间歇彻底清洁旷场。

2.3.2 悬尾试验 末次给药后1 h，将小鼠尾端2 cm部位贴在一水平支撑物上，使动物成倒挂状态，支撑物放置于一敞口箱内，其头部离底面约5 cm。记录小鼠6 min内后4 min的不动时间，各组小鼠平行操作。

2.3.3 强迫游泳试验 末次给药1次1 h后，将小鼠单独放入高20 cm、直径14 cm的圆柱型玻璃缸中，缸内水深10 cm，水温23 ～ 25 ℃。从小鼠入水后记时6 min，记录后4 min内的累计不动时间，各组小鼠平行操作。

2.4 炎症因子含量测定[6-7]

末次检测结束后，将小鼠麻醉放血处死，取脑组织，左侧脑组织置于– 80 ℃冰箱中，待测TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

2.5 脑组织透射电镜及病理学检查

将小鼠麻醉放血处死，取脑组织，右侧脑组织一部分切成0.5 m3大小组织，用4%多聚甲醛-0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.3 ～ 7.4）固定保存，做透射电镜检查；另取一部分用10%中性甲醛溶液固定，常规脱水、石蜡包埋切片、HE染色，光镜下观察病理学变化。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 知母总皂苷对血管性抑郁小鼠抑郁行为的影响

在旷场试验、悬尾试验和强迫游泳试验中，与假手术组比较，模型组小鼠水平运动得分、垂直运动得分显著降低，悬尾、游泳不动时间显著增加（P ＜ 0.05），提示小鼠出现明显的抑郁行为，表明小鼠血管性抑郁模型造模成功。与模型组小鼠相比，知母总皂苷高剂量组和氟西汀组小鼠水平运动得分、垂直运动得分明显增加（P ＜ 0.05），悬尾、游泳不动时间均缩短（P ＜0.05），提示知母总皂苷对反复缺血再灌注所致血管性抑郁小鼠的行为学有显著改善作用。结果见表1、表2。

表1 知母总皂苷对血管性抑郁小鼠旷场试验的影响. n = 10Tab 1 Effect of SAaB on open field test of vascular depression mice. n = 10

表2 知母总皂苷对血管性抑郁小鼠悬尾、游泳不动时间的影响. n =10Tab 2 Effect of SAaB on the immobility time in both of the tail suspension test and the forced swimming test in mice with vascular depression. n = 10

3.2 知母总皂苷对血管性抑郁小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影响

与假手术组比较，模型组小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量明显增加（P ＜ 0.01）。与模型组小鼠相比，知母总皂苷三个剂量组和氟西汀组小鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量均不同程度降低（P ＜ 0.05）；结果提示，知母总皂苷对血管性抑郁小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6这3种促炎性细胞因子的表达有明显的抑制作用。详见表3。

表3 知母总皂苷对血管性抑郁小鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影响. n = 10Tab 3 Effect of SAaB on TNF-α, IL-1β and IL-6 levels in brain tissue of vascular depression mice. n = 10

3.3 知母总皂苷对血管性抑郁小鼠脑组织病理学的影响

光学显微镜下观察结果详见图1，结果显示假手术组脑组织神经元及胶质细胞正常，核膜清楚，核仁明显，未见神经变性坏死及中性粒细胞浸润等病理改变；模型组脑组织中神经元结构模糊，线粒体肿胀，尼氏小体减少，出现不同程度的核固缩、核溶解，核体不规则；知母总皂苷三个剂量组可减轻血管性抑郁小鼠出现的上述脑组织病理改变，可改善大脑皮质锥体细胞和脑实质神经细胞的核固缩、核溶解程度。透射电镜超微结构观察结果表明，假手术组脑组织结构正常，神经元细胞、突触泡、小血管均正常；模型组神经元细胞变小，细胞核染色质边集、畸形，血管周围有空白区；知母总皂苷三个剂量组和阳性药氟西汀组均可改善上述现象，突触泡基本不扩张，血管空白区减小。

4 讨论

小鼠在悬尾及强迫游泳试验中出现的不动状态反映了动物的绝望行为，可模拟人类的抑郁状态[8]。本次悬尾和强迫游泳试验结果显示，知母总皂苷能显著缩短小鼠悬尾和强迫游泳不动时间，表明知母总皂苷具有抗抑郁作用，可能是通过参与调节中枢不同单胺（去甲肾上腺素、5-羟色胺等）能神经传导功能所产生的。动物发生抑郁样行为学改变，反应表现为快感缺乏、运动能力和探索能力下降[9]等，旷场试验中水平运动反映动物的活动度，垂直运动反映动物对新鲜环境的好奇程度。本实验知母总皂苷高剂量组能够显著增加小鼠水平运动得分、垂直运动得分，从而提高血管性抑郁小鼠的自主运动行为。

图1 各组小鼠脑组织病理学检查（HE，200×）A – 假手术组，B – 模型组，C – 盐酸氟西汀组，D – 低剂量组，E – 中剂量组，F – 高剂量组Fig 1 Pathological examination of brain tissue in mice (HE, 200×)A – sham group, B – model group, C – fluoxetine hydrochloride group, D – low dose group, E – middle dose group, F – high dose group

血管性抑郁发病机制的“炎症反应假说”认为，年龄及脑血管相关的炎症过程介导了其抑郁症的发生[10]。小胶质细胞作为中枢神经系统起免疫监视作用的主要细胞，可在缺血缺氧等多种病理条件下激活，释放大量促炎性细胞因子参与中枢的免疫炎症反应[11]。脑卒中患者可引起炎性细胞因子，如白细胞介素IL-1β、IL-18、TNF-α，糖皮激素、脑源性神经营养因子、血管内皮生长因子及组织型纤溶酶原激活物等一系列细胞因子的异常，这些细胞因子参与免疫调节作用及神经递质的合成代谢，构成了脑卒中后抑郁的发病机制[12]。本实验采用反复缺血再灌注法制备血管性抑郁小鼠模型，模型小鼠脑内小胶质细胞大量激活，伴有脑内相关促炎性细胞因子水平显著增高；给予知母总皂苷后，血管性抑郁小鼠脑内促炎性细胞因子水平显著降低，表明知母总皂苷可以显著抑制血管性抑郁小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6这三种促炎性细胞因子的表达。提示在以炎症反应为主导的血管性抑郁症状中，知母总皂苷可能是通过抗炎干预起到一定的治疗作用。

抑郁与脑缺血有一定关系，两者互为因果，大脑皮层及海马等部位神经元损伤有可能是其基本的病理改变[13]。血管性抑郁模型小鼠脑组织光镜下显示神经元结构模糊，线粒体肿胀，尼氏小体减少，出现不同程度的核固缩、核溶解，核体不规则；透射电镜超微结构观察结果表明，模型小鼠脑神经元细胞变小，细胞核染色质边集、畸形，血管周围有空白区。知母总皂苷明显改善血管性抑郁小鼠脑组织病理学变化，对血管性抑郁模型小鼠脑组织损伤有保护作用。

知母总皂苷抗血管性抑郁作用明显，其药材来源广泛，且中药不良反应及毒副作用较小，长期服用安全可靠，对其今后的开发和应用有着非常广阔的前景。中药具有多环节、多靶点的作用特性，对知母总皂苷抗血管性抑郁的具体作用机制，还有待深入研究。

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Effects of saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge. on the depressive behaviors of vascular depression mice and brain tissue pathology

GONG Lin1, QIU Yan2, LIU Jing2, LU Yi2, WANG Ya-wei2, DUAN Jing2, MA Jing2, ZHOU Yong3
(1. Outpatient Department, the No. 454 Hospital of PLA, Nanjing 210002, China; 2. Department of Pharmacy, the No. 454 Hospital of PLA, Nanjing 210002, China; 3. Instrument Section, the No. 454 Hospital of PLA, Nanjing 210002, China)

Objective:To investigate the effects of saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge.(SAaB) on the depressive behaviors of vascular depression mice, and the influence of brain tissue pathology and inflammatory factors.Methods:The vascular depression model of mice were established by repeated ischemia and reperfusion. The mice received gastric perfusion of SAaB as designed once per day. After 2 weeks, the depressive behavior changes of vascular depression mice were observed. Contents of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) in brain tissue were measured, meanwhile pathological changes in the brain tissue of mice were analyzed.Results:Compared with the model group, SAaB in middle and high dose group could increase horizontal movement and vertical movement score in open field test (P ＜ 0.05). In the tail suspension test and the forced swimming test of mice, the immobility time of SAaB middle and high dose group was shorter than that of the model group signif i cantly (P ＜ 0.05). Compared with the model group, SAaB in low, middle and high dose groups could signif i cantly inhibit the increase of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the mice brain tissue notably (P ＜ 0.05). The pathological examination showed that SAaB in each dosage group signif i cantly reduced the fuzzy neurons in the brain structure, mitochondria swelling, nissl body, pycnosis, irregular nuclear body in the cerebral cortex pyramidal cells and brain nerve cell nucleus. Compared with the model group, SAaB in each dosage group improved the brain neurons atrophy, synaptic vesicle expansion, nucleus chromatin edge setting, deformity and the blank area around blood vessels.Conclusion:SAaB has signif i cant therapeutic effect on vascular depression mice.

Saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge.; Vascular depression; Behavioral science; Inf l ammatory; Pathology

R964

A

1672 – 8157(2017)02 – 0088 – 05

2016-12-06

2017-03-09）

南京军区基学科研基金课题（15zD021）

周永，男，高级工程师，研究方向：医学工程。E-mail：18202138603@163.com

龚林，女，副主任医师，研究方向：神经内科。E-mail：benefi_bio@163.com