HPLC法测定保元丹中三七皂苷R1的含量

任 韡，李 欣，白 林，范金钊，黄晓舞（解放军总医院制剂中心，北京 100853）

・实验研究・

HPLC法测定保元丹中三七皂苷R1的含量

任 韡，李 欣，白 林，范金钊，黄晓舞（解放军总医院制剂中心，北京 100853）

目的：建立测定保元丹中三七皂苷R1含量的方法。方法：采用HPLC法，色谱柱：Dikma Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱；检测波长：203 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃。结果：三七皂苷R1在38.0 ～ 380.0 μg·mL-1（r = 0.999 9）范围内线性关系良好；平均回收率、RSD（n = 9）分别为99.7%、1.04%。结论：本方法简便、准确、重复性好，可用于保元丹中三七皂苷R1的含量测定。

高效液相色谱法；保元丹；三七皂苷R1；含量测定

保元丹是解放军总医院非标准制剂，由冬虫夏草、三七、西洋参等制成，该药用于补肺益气，益气升阳，利水消肿，止咳化痰，治气衰血虚，肾虚久咳，虚喘气促，腰膝酸痛，久服强身健体，延缓衰老[1]。三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根和根茎，散瘀止血，消肿定痛[2]，为保元丹的主要成分，原质量标准中无含量测定方法，本试验测定保元丹中三七的特征有效成分三七皂苷R1[3]的含量，以期为有效控制制剂的质量提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司，含1200系列在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、VWD检测器、色谱工作站）；AG-285型电子天平（瑞士Mettler公司）；超声清洗机（DZ47-60，北京精益荣华首饰器材有限公司）。

三七皂苷R1对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110745-200617）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水。保元丹（解放军总医院自制，批号：20120301、20130201、20140801）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Dikma Diamonsil（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱：0 ～ 20 min，A相比例为19%；20 ～ 70 min，A相比例由19%变为36%；70 ～ 80 min，A相比例由36%变为19%；检测波长：203 nm；柱温：40 ℃；流速：1.0 mL・min-1；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取三七皂苷R1对照品适量，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液；精密量取三七皂苷R1对照品储备液3.0 mL，置5 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（含三七皂苷R1120.84 μg・mL-1）。

2.2.2 供试品溶液 取本品内容物约2.5 g，精密称定，置100 mL碘量瓶中，加50 mL甲醇，密塞，超声处理（功率：250 W，频率：50 kHz）50 min，放冷，过滤，蒸干。残渣用乙腈-水（19 : 81）溶解并转移至10 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方比例取除三七以外的其余成分，按本制剂的制备工艺制成阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。

2.3 系统适用性实验

取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，三七皂苷R1的保留时间约为37 min，峰形对称尖锐，基线平稳，与其他色谱峰分离良好，阴性样品无干扰，详见图1。

图1 HPLC色谱图A – 对照品，B – 供试品，C – 阴性对照；1 – 三七皂苷R1Fig 1 HPLC chromatogramsA – reference substance, B – sample, C – negative reference substance; 1 – notoginsenoside R1

2.4 线性关系考察

精密称取三七皂苷R1对照品适量，用甲醇稀释，制成含三七皂苷R1为38.0、76.0、95.0、171.0、380.0 μg・mL-1的系列标准溶液。取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积值为纵坐标（Y），对照品溶液浓度（μg・mL-1）为横坐标（X）绘制标准曲线，得回归方程：Y= 2.952X+ 2.349 1，r= 0.999 9。实验结果表明三七皂苷R1在38.0 ～ 380.0 μg・mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度实验

精密吸取对照品溶液（含三七皂苷R1120.84 μg・mL-1）10 μL，按“2.1”项下色谱条件，连续重复进样6次，记录峰面积值，计算三七皂苷R1的RSD为0.13%，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性实验

取同一供试品（批号20140801），按供试品溶液制备方法分别制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，三七皂苷R1的平均含量为0.60 mg・g-1，RSD（n= 6）为1.55%。结果表明此法重复性良好。

2.7 稳定性实验

取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、10、24 h进样测定，三七皂苷R1峰面积的RSD为0.91%（n= 6），表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.8 回收率实验

取已知含量的样品（批号20140801）9份，每份约2.5 g，精密称定，精密加入三七皂苷R1对照品溶液（201.4 μg・mL-1）6.0 mL，7.5 mL，9.0 mL，按“2.2.2”项下方法制成低、中、高（80%、100%、120%）3个浓度的样品溶液各3份。按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图及峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 保元丹回收率实验测定结果. n = 9Tab 1 Results of recovery test in Baoyuandan. n = 9

2.9 样品含量测定

取3批样品，每批3份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见表2。

表2 保元丹中三七皂苷R1的含量. n = 3Tab 2 Contents determination of notoginsenoside R1in Baoyuandan. n = 3

3 讨论

3.1 定量指标的选择

《中国药典》2015年版一部“三七”项下含量测定方法是以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1为测定指标，“西洋参”项下含量测定方法是以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re为测定指标，故三七皂苷R1为三七药材的特征有效成分，本实验建立三七皂苷R1的HPLC含量测定方法，为有效控制制剂的质量提供参考。

3.2 样品处理方法的优化

本品内容物为棕褐色膏体，本研究中供试品溶液的制备采用流动相进行稀释并滤过，有效避免基质遇流动相析出，减少对色谱柱及液相色谱系统的损坏[4]。本研究比较了溶剂回流提取[2,5]和超声波振荡提取法[6-7]，结果表明两者提取率大致相同。超声振荡提取法，省时简便，故本研究选择超声提取。并考察了超声30、40、50、60 min对含量的影响，研究结果表明超声50 min成分已提取完全，曾浸泡24 h后再行超声处理，含量没有明显提高，因此选择50 min直接超声。保元丹为油性膏体，用乙醚、正丁醇萃取损失较多，且提取效果没有很大改变。

3.3 色谱条件的选择

参考《中国药典》2015年版一部“三七”项下含量测定方法，选择乙腈-水梯度洗脱，12 min乙腈比例为19%，60 min乙腈比例为36%，结果分离效果不好。改用本试验的流动相比例，分离良好，阴性样品无干扰。曾用乙腈-0.1%磷酸流动相系统，分离效果没有显著改善。其他色谱条件相同，分别在柱温25、30、35、40 ℃下测定，发现在40 ℃时基线平稳，色谱峰峰形尖锐，与其他色谱峰分离良好，阴性样品无干扰。

3.4 色谱柱的选择

本次研究中，比较了Agilent Zorbax SB-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）和Dikma Diamonsil （250 mm×4.6 mm，5 μm）两种色谱柱，结果表明两种色谱柱对三七皂苷R1的分离效果均较好。

[1] 金道山，梅世昌，江朝光，等.保元丹对常见老年病的临床作用观察[J].中华保健医学杂志，2009，11（2）：108-110.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：11-12.

[3] 穆婷，赵昶灵，陈中坚，等.三七绿紫过渡地上茎的花色苷和皂苷组织定位及其含量分析[J].西北植物学报，2016，36（9）：1772-1780.

[4] 白林，范金钊，徐风华，等.HPLC法测定复方樟脑软膏中樟脑的含量[J].中国药物应用与监测，2014，11（4）：212-213，258.

[5] 陈文珠，袁小红.HPLC法测定跌打巴布剂中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的含量[J].中国医药指南，2013，11（9）：62-63.

[6] 来国防，徐怡，张元杰．HPLC法测定痛舒胶囊中三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Rb1[J].药学研究，2013，32（2）：63-65.

[7] 陆燕，潘旭.三七总皂苷中代表性皂苷含量测定方法学的建立及稳定性研究[J].中国药物应用与监测，2014，11（2）：88-91.

Determination of notoginsenoside R1in Baoyuandan by HPLC

REN Wei, LI Xin, BAI Lin, FAN Jin-zhao, HUANG Xiao-wu(Preparation Center, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)

Objective:To establish the HPLC method for content determination of notoginsenoside R1in Baoyuandan.Methods:HPLC analysis was carried out on Dikma Diamonsil C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) and with gradient elution of acetonitrile and water. The detection wavelength was 203 nm, the fl ow rate was 1.0 mL·min-1and the column temperature was 40 ℃.Results:Notoginsenoside R1showed a good linear relationship in the range of 38.0 – 380.0 μg·mL-1(r = 0.999 9). The recovery and RSD of notoginsenoside R1in Baoyuandan (n = 9) were 99.7% and 1.04% respectively.Conclusion:The method is simple, accurate and repeatable, which is suitable for the content determination of notoginsenoside R1in Baoyuandan.

HPLC; Baoyuandan; Notoginsenoside R1; Content determination

R917

A

1672 – 8157(2017)02 – 0081 – 03

2016-10-24

2016-12-05）

军队医疗机构单品种制剂质量标准提高项目课题（14TG0231）

黄晓舞，女，副主任药师，研究方向：药物管理与质量控制。E-mail：huangxw301@163.com

任韡，女，药师，主要从事药物分析与药品质量控制。E-mail：yewell2013@126.com