大岩桐试管正常苗与玻璃化苗叶表结构比较

韦梅琴 +唐楠++张文莲+胡鲜宁

摘要：以大岩桐试管苗为试材，用改良过的过氧化氢-醋酸离析法制片，光学显微镜下观察并比较试管正常苗与玻璃化苗的叶表结构。结果发现，2类试管苗的上下表皮均有气孔器、腺毛、表皮毛的分布，但它们的数量与气孔特征具有显著差异。与试管正常苗相比，玻璃化苗上下表皮细胞单位面积表皮毛、腺毛、气孔器密度减少，保卫细胞形态异常，气孔器的长度差异不明显，但气孔器宽度、相对开张度均较正常苗显著增大，是正常试管苗的2倍。此外，玻璃化苗与外界进行气体和水分交换量明显大于正常苗，从而导致玻璃化苗持水能力弱、易失水，这是试管玻璃化苗在继代、生根培养中不能正常生长、极易死亡的主要原因。

关键词：大岩桐；试管正常苗；玻璃化苗；叶表皮；比较

中图分类号： Q945.45文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）04-0093-03

大岩桐（Sinningia speciosa）属苦苣苔科苦苣苔属多年生草本植物，别称落雪泥，原产于巴西，是点缀和装饰室内及窗台的理想盆花。目前围绕大岩桐做了过量表达CFL以及激素处理改变花的发育与调控作用及其机理研究、再生体系的建立和优化及遗传转化等研究[1-9]；大岩桐常规的繁殖方法一般用播种、枝插、分球茎等方法来进行，但繁殖系数低，满足不了人们的需求。而利用组织培养的方法可有效提高繁殖系数，为大岩桐的快繁提供保障；但在组织培养过程中不可避免地出现异常苗，胡鑫等对大岩桐再生植株经过连续组织培养以后，发现了如叶序的改变和花的同源异型现象等表型突变[9]，在大岩桐后期的继代培养中见到了玻璃化苗，其增殖能力较低，难以生根成苗，对组培体系的稳定性和种苗生产造成严重的影响[2，9]。本试验针对大岩桐试管正常苗和玻璃化苗的叶片，进行叶表结构比较，试图从解剖学的角度探讨试管玻璃化苗在继代培养中不能正常生长、极易死亡的原因，为深入研究试管玻璃化苗的机理提供理论参考。

1材料与方法

1.1试验材料

取温室中生长较为健壮的大岩桐茎尖，经过初代培养、继代培养获得试管正常苗与试管玻璃化苗。

1.2方法

以大岩桐试管正常苗和试管玻璃化苗为试材，2类苗各取6株，从顶端向下取第3张叶片，将叶片中上部主叶脉两侧部位剪成1 cm左右的方块。将上述叶片方块用改良过的过氧化氢-醋酸离析法对上、下表皮进行离析，1%番红染色，中性树胶封片；在奥特BK-5000（OPTEC-BK5000）光学显微镜下观察、拍照；利用测微软件TSView对上、下表皮的气孔进行观察计数，测定气孔的长和宽，气孔开口长、开口宽等指标；所得数据均为20个视野下的平均值。

气孔密度：

[JZ]D=S/M。

式中：D为气孔器密度；S代表整个视野内的气孔数目；M代表每个视野的面积。

气孔相对开张度：

[JZ]气孔相对开张度=气孔开口宽/气孔开口长×100%。

1.3数据分析

数据用Excel2003及SPSS 13软件进行方差分析。

2结果与分析

2.1大岩桐试管正常苗和玻璃化苗形态特征

取温室中生长的大岩桐茎尖，经过离体培养获得无菌初代培养物，在初期的培养中试管苗生长健壮无异常现象，在后期的继代培养中才可见玻璃化苗，并随培养代数增加，玻璃化加重。离体培养条件下的试管正常苗和试管玻璃化苗的叶的形状和株高差异不大，其株高均在7～8 cm左右，叶对生，卵圆形或长椭圆形，有锯齿；但叶片的大小与颜色有明显的不同，即试管正常苗的叶片小而厚、叶色呈深绿色，而玻璃化苗的叶片大而薄，整个叶片明显失绿，色泽呈粉红色，仅在葉片的叶脉附近可见少量绿色，未有肿胀或明显的水浸状，这类苗增殖分化能力较低，难以进行生根培养（图1）。

2.2叶表结构

大岩桐的叶表结构由表皮细胞、表皮毛及气孔器等几部分组成。2类试管苗的叶表结构差异主要表现在表皮细胞的形状、气孔复合体的大小、密度等方面（表1、图2）。

2.2.1表皮细胞的形状及其附属物

光学显微镜下2类试管苗叶的表皮细胞形状明显不同，即试管正常苗叶片的上、下表皮细胞呈多边形，垂周壁平直或弓形；试管玻璃化苗的上、下表皮细胞呈不规则形状其垂周壁上表皮的为浅波形，下表皮的为深波形。大岩桐试管苗表皮细胞上的附

从气孔长/宽的值看，大岩桐试管正常苗上表皮比值为0.96，下表皮比值为1.01，比值都在1左右，说明大岩桐试管正常苗的气孔器近乎圆形；玻璃化苗上表皮比值为0.72，下表皮比值为0.88，可见气孔形状呈扁圆形（表2、图2）。同时还存在气孔发育不完善现象：（1）气孔器开口极大，开口形状有长方形、月牙形与圆形等；（2）2个保卫细胞发育不平衡，大小不等（图2-E至图2-H）。试管正常苗下气孔的相对开张度0.51，玻璃化苗的0.98，开口近乎圆形；试管正常苗上气孔的相对开张度0.34，玻璃化苗的0.64，二者差异显著。可见，不论是上表皮还是下表皮，玻璃化苗的气孔的相对开张度是正常试管苗的2倍。

2.2.2.2气孔密度

大岩桐试管正常苗的上表皮气孔密度（188.66±14.13）个/mm2，下表皮气孔密度（191.46±21.90）个/mm2，上、下表皮细胞之间气孔密度差异不明显；试管玻璃化苗的上表皮气孔密度为（135.31±20.67）个/mm2，下表皮气孔密度（175.66±15.36）个/mm2（表2）。由此可见，同一类型的试管苗表现为下表皮气孔数量大于上表皮的；不同类型的试管苗，不论上表皮还是下表皮均表现为试管正常苗的气孔密度多于试管玻璃化苗的气孔密度，两者差异显著，这与槐树和丝石竹中的结果[10-11]相反。

3结论与讨论

玻璃化苗是植物组织培养中特有的一种生理性病变，在组织培养中普遍存在[10-11]。它作为一种畸型苗，在形态特征上一般表现为植株矮小、茎叶肿胀畸形、组织半透明水浸状、叶色为海绿色、组织质脆易断等[12]。大岩桐玻璃化苗外部形态与正常苗无明显差异，植株具有明显的节与节间，叶片大而薄，没有肿胀多汁现象，整个叶片明显失绿，色泽呈粉红色，仅在叶片的叶脉附近可见少量绿色，未有肿胀或明显的水浸状。P[KG-*5]a[DD（-1*2][HT6]^[DD）]ques认为，玻璃化苗可分为外观形态明显异常与基本无异常2种类型，大岩桐玻璃化苗形态与后者相似，属于基本无异常类型[13]。这可能受培养条件的影响，使得外植体在培养基中分别导致非多汁和多汁玻璃苗的产生[14]，同时也与植物种类、基因型的差异有关，长期的组织培养导致内源激素水平发生改变，随着培养时间的延长，瓶内气体积累不断增加，引起植物对物质的利用受阻，从而导致试管玻璃化的发生[15]。

叶片表皮是植物体和外界环境接触的最外层组织，气孔器是调节气体出入和水分蒸腾的重要结构，与植物的光合作用、蒸腾作用直接相关[16]。2类试管苗气孔器的长度变化不明显，而气孔器的宽度和长宽比差异显著，玻璃化苗的气孔相对开张度较正常苗显著增大，是正常试管苗的2倍，说明环境对2类试管苗的气孔特性的影响程度不同。槐树、丝石竹、苹果的离体培养研究表明，玻璃化后叶片上、下表皮气孔数明显增多[10-11，17]，而笔者的结果与之相反，但与芥菜的玻璃苗结论[18]一致，即单位面积内气孔数减少，这可能与玻璃化苗叶片的大小有关。与试管正常苗相比，大岩桐玻璃化苗叶面积显著增大，使得气孔在单位叶面积内的分布量下降，可见气孔密度的变化与叶面积的变化有一定的联系。

此外，玻璃化苗与正常苗在内部解剖结构上也存在明显差异。与正常试管苗相比，玻璃苗叶片的机械组织较弱、维管束组织发育不良[11，17，19-20]，从而影响体内生长素的极性运输，使得玻璃化苗的内源生长素分布状况发生改变，导致营养物质和水分运输不畅通[20-21]；叶表附属物——表皮毛及腺毛较少；气孔器异常、发育不完全，开口较大。这些特点显示出玻璃化苗与外界进行气体（包括水、气）交换的途径明显较正常苗的增大[14]，持水能力较弱；同时叶片叶色褪绿，不能行使正常的光合作用，最终导致其新陈代谢和生理功能失调[22-23]，这是试管玻璃化苗在继代培养、生根培养中不能正常生长，极易死亡的主要原因之一[17]。因此，在大岩桐试管苗的培养过程中，控制继代培养次数对减少玻璃化的发生至关重要。玻璃化的产生也与培养基成分、培养条件等密切相关，因此如何控制这类物质的用量以防止大岩桐试管苗玻璃化的发生有待进一步研究。

参考文献：

[1]曹桂萍，王建美. 大岩桐的组织培养与快速繁殖研究[J]. 山东农业科学，2002（5）：16-16，22.

[2]徐全乐，谢亚红，刘文婷，等. 大岩桐高频再生体系建立的两种途径[J]. 园艺学报，2010，37（1）：135-140.

[3]邵果园，梁国鲁，王力超，等. 大岩桐快繁体系优化研究[J]. 西南大学学报（自然科学版），2007，29（4）：127-130.

[4]周锺信，李建科，朱惠珍，等. 大岩桐开花生物学的观察及快繁技术的研究[J]. 天津农学院学报，1998，5（2）：1-8.

[5]李达. 大岩桐再生体系的建立及遗传转化的研究[D]. 泰安：山东农业大学，2013.

[6]张明哲. 大岩桐过量表达CFL以及激素处理改变花的发育[D]. 杭州：浙江大学，2008.

[7]李晓燕. miR159和miR172表达对大岩桐花发育的调控作用及其机理研究[D]. 杭州：浙江大学，2012.

[8]郭丽. 大岩桐遗传转化体系的建立与LEA蛋白基因的导入[D]. 重庆：西南大学，2008.

[9]胡鑫，徐全乐. 连续组织培养引起大岩桐再生植株的表型变化[J]. 西北农业学报，2010，19（5）：167-170.

[10]王纪方，李锡香，贾春兰，等. 丝石竹玻璃苗生理特性和形成机理初探[J]. 农业生物技术学报，5（1）：72-78.

[11]王喆之，胡正海. 槐树试管正常苗与超度含水态苗茎叶的比较形态学研究[J]. 植物学报，1997，39（7）：647-652.

[12]Ziv M. Vitrification：morphological and physiological disorders of plants[M]//Debergh P C，Zimmerman R H. Micropropagation，technology and application. Dorderecht：Kluwer Academic Publ，1991：45-70.

[13]Pa[DD（-1*2][HT6]^[DD）]ques M. Vitrification and micropropagation：causes，remedies and prospects[J]. Acta Horticulturae，1991，289：283-290.

[14]Pa[DD（-1*2][HT6]^[DD）]ques M，Boxus P.A model to learn “vitrification”，the rootstock apple M.26 present results[J]. Journol of Geophysical Research Oceans，1991，96（C4）：7023-7048.

[15]Sriskandarajah S，Serek M. Regeneration from phylloclade explants and callus cultures of Schlumbergera and Rhipsalidopsis[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2004，78（1）：75-81.

[16]馬书荣，阎秀峰，陈伯林，等. 遮光条件下裂叶沙参和泡沙参气孔行为的对比研究[J]. 植物研究，2000，20（1）：63-68.

[17]葛红娟，梁美霞，戴洪义. 玻璃化与正常苹果试管苗的叶片和茎的显微结构比较[J]. 植物生理学通讯，46（3）：223-227.

[18]陈国菊，雷建军. 芥菜离体培养中玻璃化机理的研究[J]. 西南农业大学学报，22（3）：237-239.

[19]常有宏，张玉娇，李晓刚，等. “黄冠”梨正常试管苗与玻璃化苗生理生化及超微结构的比较研究[J]. 园艺学报，2011，38（2）：225-232.

[20]韦梅琴，郑江伟. 东方百合试管正常苗与玻璃苗叶片解剖结构的比较[J]. 北方园艺，2007，（12）：203-205.

[21]梁海曼，周菊华. 试管苗玻璃化现象的生理生化和机理探讨[J]. 武汉植物学研究，12（3）：281-288.

[22]杨俊英，罗庆熙，宋明，等. 大蒜试管苗玻璃化机理的研究[J]. 西南农业学报，2005，18（6）：801-805.

[23]李云，田砚亭，罗晓芳. 珠美海棠试管苗玻璃化发生机理的初步研究[J]. 北京林业大学学报，18（1）：52-58.