IL1R1基因多态性与黑衣壮儿童哮喘的相关性研究

蔡旭龙 林玛丽 曹珊 林娜

【摘要】目的研究白介素1受体Ⅰ型（Interleukin 1 receptor，type Ⅰ，IL1R1）基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点rs1558641和rs949963与哮喘易感的相关性。

方法采用病例对照的研究方法，收集广西百色地区属于壮族分支的黑衣壮人群，哮喘儿童80例，健康儿童100例，通过聚合酶链反应连接酶检测反应（polymerase chain reactionligase detection reaction，PCRLDR）对IL1R1的rs1558641和rs949963位点多态性进行基因分型。

结果IL1R1基因rs1558641位点检测出CC、CT、TT基因型，rs949963位点检测出AA、AG、GG基因型，两个位点基因型、等位基因在哮喘和健康组中分布均有统计学意义（P<0.05）；通过SHEsis软件计算连锁不平衡（LD）的系数，结果D=1，r2=1。

结论IL1R1基因SNP位点rs1558641和rs949963有完全连锁现象，rs1558641和rs949963位点多态性可能是黑衣壮儿童哮喘的易感因素。

【关键词】IL1R1；多态性；哮喘；黑衣壮

中图分类号：R725.6文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2017.01.002

A study on association of IL1R1 gene polymorphism with asthma in blackclothing Zhuang children

[HJ1*2][HJ]

CAI Xulong1，LIN Mali1，CAO Shan1，LIN Na2▲

（1.Graduate School，2.Department Pediatrics of Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

[HJ2][HJ]

【Abstract】ObjectiveTo study relationship between single nucleotide polymorphism（SNP） site rs1558641 and rs949963 of interleukin 1 receptor，type （IL1R1） and susceptible asthma.

MethodsCasecontrol study was adopted in this research.80 children with asthma and 100 healthy controls in blackclothing Zhuang people in Baise area of Guangxi were collected.And then，polymorphism genotyping was performed through polymerase chain reactionligase detection reaction （PCRLDR），so as to carry out polymorphism genotyping of rs1558641 and rs949963 loci in IL1R1.

ResultsCC，CT and TT genotypes were detected in IL1R1 gene rs1558641 locus，and AA，AG and GG genotypes were detected in rs949963 locus.Distributions of genotypes and alleles of the two locus（rs1558641 and rs949963） in asthma group and healthy group all had statistically significant difference（P<0.05）.The coefficient of linkage disequilibrium （LD） was calculated by SHEsis software，and the results was：D=1，r2=1.

ConclusionThere is a complete linkage between SNP rs1558641 and rs949963 locus in IL1R1，so polymorphisms rs1558641 and rs949963 locus may be susceptible factors of asthma children in blackclothing Zhuang population.

【Key words】IL1R1；polymorphism；asthma；blackclothing Zhuang population

哮喘疾病是世界性難题，患者在不断增加，目前全球范围约有3亿患者。哮喘使患者及其家庭经济负担加重，生活质量也受较大影响。哮喘是由嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞、黏液细胞等多种细胞参与的以慢性气道炎症为特征的一种异质性的疾病，表现为喘鸣、气短、胸闷、咳嗽和呼气气流受限。哮喘发病机制复杂，目前尚不十分清楚，与环境因素和遗传因素关系密切。白介素1受体Ⅰ型（IL1R1）在大多数细胞上表达，作为白介素1（IL1）的受体，在IL1信号通路中起重要作用。有研究表明IL1R1可以放大IL1作用，与炎症反应、哮喘和过敏性疾病关系密切[1]。本次研究IL1R1基因rs1558641和rs949963位点的多态性与黑衣壮儿童哮喘的相关性。

1对象与方法

1.1研究对象

2015年6月至2016年5月期间在右江民族医学院附属医院门诊和病房收集80例哮喘儿童，男48例，女32例，年龄2.3～8.3岁，平均（4.3±1.3）岁，哮喘诊断符合2008年儿童支气管哮喘诊断标准[2]。100例健康儿童作为对照，为同期体检的健康儿童，男65例，女35例，年龄3.8～5.7岁，平均（4.5±0.7）岁，无过敏史，家族中无哮喘及其他免疫性疾病患者。两组研究对象三代均为黑衣壮，相互之间无血缘关系。在年龄及性别组成上两组差异无统计学意义（P>0.05）。根据知情同意原则，与患儿家长签订知情同意书，并经过医院伦理委员会批准。

1.2主要试剂和仪器

东胜龙黑金刚EDC810 PCR仪（北京东胜创新生物科技有限公司）；3730XL基因测序仪（ABI公司）；Allegra 25R高速离心机（贝克曼公司）；Micro 17R微量台式离心机（赛默公司）；微量可调移液器（Eppendorf公司）；Taq酶（Fermentas公司）；dNTP（Fermentas公司）；Taq DNA ligase（NEB公司）；人血液DNA提取试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.3标本采集

空腹抽1 ml静脉血，存放在EDTA抗凝管中，用于DNA的提取，收集的标本保存在-80℃冰箱待检。

1.4IL1基因多态性分析

用人全血DNA提取试剂盒提取DNA（上海捷瑞生物工程有限公司），提取的DNA由上海捷瑞生物工程有限公司用聚合酶链反应连接酶检测反应（PCRLDR）对基因位点进行基因单核苷酸多态性（SNP）分型。扩增rs1558641位点和rs949963位点的引物及探针序列见表1。PCR扩增：总反应体积为15 μL，10×Buffer 1.5 μL，MgCl2 1.5 μL，DNTP 0.3 μL，引物0.15 μL/条，Taq酶0.3 μL，模板DNA 1 μL，双蒸水补至15 μL。充分混匀，放入PCR扩增仪扩增。PCR反应体系于94℃预变性3 min后，按程序94℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 90 s 扩增35个循环，最后 72℃延伸3 min。连接反应：总反应体积为10 μL PCR产物3 μL，10×Taq DNA ligase buffer 1 μL，Taq DNA ligase（40 U/μL）0125 μL，探针（10 pmol/μL）0.01 μL/条，H2O补至 10 μL。连接条件：94℃ 30 s→56℃ 3 min 扩增30个循环。取1 μL反应产物，加8 μL上样loading buffer，95℃变性3 min，立即冰水浴，上测序仪测序。

1.5统计学方法

采用 SPSS 17.0 软件进行数据的统计分析，两组的基因型和等位基因用计数法计算频率，HardyWeinberg遗传平衡定律检验群体代表性，两组的基因型频率和等位基因频率采用χ2检验作比较，检验水准：α=0.05。

2结果

2.1SNP各种基因表型结果

通过LDR反应产物的测序长度对各基因型进行判断，纯合子只有1种片段长度，杂合子包含2种纯合子的片段长度。rs1558641位点根据所设计的探针，C基因型的片段长度为57 bp，T基因型的片段长度为60 bp。rs949963位点根据所设计的探针，A基因型的片段长度为78 bp，G基因型的片段长度为81 bp。经3730XL基因测序仪（ABI公司）基因检测，GeneMarker V1.5分析，SNP分型结果显示rs1558641和rs949963位點均分别有CC、CT、TT和AA、AG、GG 3种基因型（图1、2）。

2.2IL1R1多态性位点基因型及等位基因分布频率

哮喘组及健康对照组均符合HardyWeinberg遗传平衡定律（P>0.05），有群体代表性。rs1558641和rs949963位点基因型频率及等位基因频率在健康对照组和哮喘组之间分布均有统计学意义（P<0.05）。见表2、表3。

2.3rs1558641和rs949963位点连锁不平衡情况

连锁不平衡（LD）又称等位基因关联，是指同一条染色体上，两个等位基因间的非随机相关，即两个等位基因（A，B）位于同一条染色体的同时存在的概率（PAB）大于人群中因随机分布而同时出现的概率时，就称这两个位点处于LD状态。通过SHEsis软件计算连锁不平衡的系数D和r2来衡量LD强度，结果D=1，r2=1，说明rs1558641和rs949963位点完全连锁。

注：箭头所指A图单峰表示CC基因型；B图双峰为CT基因型；C图呈现单峰为TT基因型。

图1IL1R1基因SNP rs1558641位点基因表型结果

注：箭头所指A图单峰表示AA基因型；B图双峰为AG基因型；C图呈现单峰为GG基因型。

图2IL1R1基因SNP rs949963位点基因表型结果

表2IL1R1基因rs1558641位点基因型频率和等位基因频率比较[n（%）]

组别n

基因型频率CCCTTTχ2P

等位基因频率CTχ2P

健康对照组10063（63.0）34（34.0）3（3.0）6.1280.047160（80.0）40（20.0）5.3920.020

哮喘组8040（50.0）31（38.7）9（11.3）111（69.4）49（30.6）

表3IL1R1基因rs949963位点基因型频率和等位基因频率比较[n（%）]

组别n

基因型频率GGAGAAχ2P

等位基因频率GAχ2P

健康对照组10063（63.0）34（34.0）3（3.0）6.1280.047160（80.0）40（20.0）5.3920.020

哮喘组8040（50.0）31（38.7）9（11.3）111（69.4）49（30.6）

3讨论

哮喘在各个年龄段均可以发病，但多数发生在儿童期。哮喘对儿童的学习、生活影响巨大。哮喘是由环境和遗传共同作用的复杂疾病，特点是气道平滑肌收缩，黏液分泌过度、水肿和气道高反应性[4]。环境因素触发或调节哮喘发生，而哮喘遗传因素易感性尚没有完全了解。单核苷酸多态性分析已被广泛应用于复杂遗传性疾病的研究。全基因组关联研究发现目前哮喘相关的候选基因超过300个，其中IL1R1基因与哮喘有关[6～7]。也有研究发现IL1R1与癌症、睡眠的调节有关[8～9]。

IL1R1位于染色体2q12区域，该区域内的许多基因均与哮喘相关[10]，与IL1R2、IL1RL2和IL1RL1形成细胞因子受体基因簇。IL1R1是白细胞介素1受体家族的一员，是一种糖蛋白，分子量约为80 kDa，主要表达于内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、肝细胞、成纤维细胞、表皮细胞、表皮树突状细胞和T淋巴细胞[11]。Schmitz等[12]用哮喘的小鼠模型研究发现IL1R1在轻型和重型哮喘发病机制中有重要作用。

在本次研究中rs1558641和rs949963位点基因型频率成对出现，经计算分析这两个位点完全连锁，千人基因组数据库中中国汉族也完全连锁。rs1558641位点基因型和等位基因频率在健康组和哮喘组之间分布均有统计学意义（P<0.05），rs949963位点的数据结果与rs1558641位点相同。rs1558641位点中TT基因型可能是哮喘的易感基因型，T等位基因可能是患哮喘的风险因子。在rs949963位点的研究中AA基因型可能是哮喘的易感基因型，A等位基因可能是患哮喘的風险因子。Chen J等研究中国汉族人群rs1558641位点多态性与FEV1%和总血清IgE相关，该位点多态性与哮喘临床特征相关[13]。

本次研究rs1558641和rs949963位点多态性在黑衣壮人群中完全连锁，与千人计划组数据库中北京地区汉族人群的研究结果一致。IL1R1基因的rs1558641和rs949963位点多态性可能是壮族儿童哮喘的风险因素。本次研究的样本量少，结果可能有偏颇。今后需进一步广泛深入研究，与其他民族或人种综合比较分析，进一步了解哮喘发病机制。

参考文献

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[10]Schmitz N，Kurrer M，Kopf M.The IL1 receptor 1 is critical for Th2 cell type airway immune responses in a mild but not in a more severe asthma model[J].Eur J Immunol，2003，33（4）：9911000.

[11]Chen J，Zhang J，Hu H，et al.Polymorphisms of RAD50，IL33 and IL1RL1 are associated with atopic asthma in Chinese population[J].Tissue Antigens，2015，86（6）：443447.

（收稿日期：2016-11-24修回日期：2016-12-26）

（编辑：潘明志）