斑马鱼鳍和鳞片色素细胞的显微观察

林金杏, 冯丽萍, 胡建华, 高 诚

(上海实验动物研究中心, 上海201203)

斑马鱼鳍和鳞片色素细胞的显微观察

林金杏, 冯丽萍, 胡建华, 高 诚

(上海实验动物研究中心, 上海201203)

目的 观察斑马鱼鳍和鳞片色素细胞的组成、分布及形态特征。方法 应用光学显微镜对AB品系斑马鱼鳍和鳞片色素细胞的显微结构进行观察。结果 斑马鱼鳍上分布有黑色素细胞和黄色素细胞，未观察到虹彩细胞。根据色素细胞的分布规律，将斑马鱼鳍分为有、无斑马鱼条纹两类。鳞片中分布有黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞。黑色素细胞较大，形态上主要分为呈树突状、颜色较浅、体积较大的I类黑色素细胞和呈团状、颜色较深、个体较小的II类黑色素细胞。黄色素细胞个体最小，呈黄色或者橙黄色。虹彩细胞较长呈长棒状或梭形，数量最少。结论 斑马鱼体表有黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞三种类型色素细胞，但鳍和鳞片在色素细胞组成和分布上存在着差异，鳞片中色素细胞的种类和形态特征较鳍中色素细胞更丰富。

斑马鱼; 鳍; 鳞片; 色素细胞; 黑色素细胞; 黄色素细胞; 虹彩细胞

鱼类体色多种多样, 同种不同个体, 雌雄之间都有可能不同。一般认为，鱼类体色主要取决于皮肤和鳞片含有的色素细胞的种类及其不同数量分布[1,2]。硬骨鱼类的色素细胞起源于神经嵴细胞[3]。相对于哺乳动物的一种色素细胞，硬骨鱼具有多种色素细胞，根据所含的色素颗粒、色素色、运动性等可分为黑色素细胞(melanophore)、黄色素细胞(xanthophore)、红色素细胞(erythrophore)、虹彩细胞(iridophore，又名鸟粪素细胞)和白色素细胞(leucophore)五种类型[4]。

斑马鱼(Danio rerio)属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae)Danio属的一种热带鱼。斑马鱼因个小易饲养、胚胎透明、繁殖力强、再生能力强、与人类基因高度同源及完整的基因组注释等优点, 正在逐渐成为一种重要的脊椎模式动物新星[5-8],广泛应用于遗传学、免疫学、发育生物学、药物学、行为学、毒理学、疾病模型等领域的研究[7-11]。目前，实验动物已不限于大、小鼠等哺乳类动物，美国国立卫生研究院(NIH)已将斑马鱼列为第三大实验动物[12]。NIH的研究资助金分析书表明，斑马鱼获得的资助款年年攀升，从2008年时占R01 (研究计划基金Research Project Grants)奖项的0.8%，2015年上升到1.27%，其研究经费已经超过了线虫(Caenorhabditis elegans，0.98%)和爪蛙(Xenopus frogs，0.57%)[13]。在过去的十年中，我国的斑马鱼研究也得到了飞速发展，成立了国家斑马鱼资源中心(China Zebrafish Resource Center，CZRC)[14]，利用斑马鱼开展有关科研工作的实验室已达250个以上[15]，在胚胎发育调控机制、疾病模型、免疫机制、药物筛选及环境检测等方面开展了卓有成效的工作。

由于国内在斑马鱼研究方面的历史有限，相关研究的基础资料和参考标准需要充实和完善。成熟的组织学平台和结构模式的建立对于斑马鱼应用的推广应用是个极大的促进，能减少无谓的动物处死和提供正常组织的参考。本课题组曾对斑马鱼重要器官进行了一系列的形态结构研究，包括肝脏胆管系统、肠道、生殖系统(卵巢和精巢)、神经系统(脑)等器官[16-21]。斑马鱼是一种研究色素模式形成机制的良好动物模型[22-24]。斑马鱼各器官和组织在解剖学、组织学上和分子水平上已被证实与哺乳动物类似，但鱼类特有鳍和鳞的结构及其体色特征与哺乳动物相差甚远。目前国内外鲜有斑马鱼色素细胞形态的详细报道，因此，对斑马鱼体色(鳍和鳞片色素细胞)的研究有助于推进其作为水生实验动物的应用。斑马鱼野生型品系纯系主要有TU和AB,本文将选用AB品系斑马鱼，通过光学显微镜对其鱼鳍和鳞片的色素细胞进行记录并分析，完善斑马鱼形态学资源库，为后续的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验用鱼饲养于本单位[SYXK(沪)2013-0056]独立水生动物养殖系统(ZB2550SASX5，意大利Tecniplast)，水温28.5±0.5 ℃, 光照周期明14 h∶暗10 h, 水体pH 7.0～7.5, 电导率500～550 μS/cm,每日两次定时喂养。选用30尾30～35周龄的已经性成熟的野生型AB系斑马鱼，雌雄各半，全长3.60～4.20 cm，体长2.80～3.45 cm，体质量0.38～0.70 g。取材前禁食12 h，并用0.016% MS-222麻醉处死。

1.2 样品制备与观察

体视显微镜(Stemi 508, Zeiss, 德国)下, 完整剪取斑马鱼的背鳍、胸鳍、腹鳍、臀鳍和尾鳍(图1),用分离针分别剥离鳍相连体位的鳞片3～5片、背部前后两处和侧线附近条纹上的3～5鳞片(图1中圆点示鳞片剥离点)，分别置于生理盐水中。斑马鱼鳍和鳞片较薄且透明，制作临时玻片后可直接在光学显微镜(DP 80，Nikon，日本)下观察。用CellSens Standard软件对各个部位的不同种类的色素细胞进行拍照并测量细胞大小。

1.3 统计与分析

所得数据采用SAS 8.0软件中GLM过程进行方差分析, 检验误差为5%水平, 数据用平均值±标准误表示, 用GraphPad Prism 5.0软件作图。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 斑马鱼鳍色素细胞的种类和形态

图 1 斑马鱼鳍和鳞片的色素细胞观察点

在斑马鱼鳍上，可观察到黑色素细胞和黄色素细胞两种类型的色素细胞(图2)。黑色素细胞表现出两种不同的形态：I类为细胞体积较大(直径50.57±1.99 μm，n=75)，颜色较浅，树突较为明显，呈散射状(图2A)、弥散状(图2B)或分枝状(图2C); II类为细胞体积较小(直径25.52±0.99 μm, n=75)，颜色较深，无树突形态，呈高密度的团块状(图2B)。偶尔可见处于分裂期明显双核的黑色素细胞(图2D)。黄色素细胞呈黄色或者橙黄色颗粒状(图2E)，单独或者零散地分布于黑色素细胞间，但极少见黑色素细胞分散于黄色素细胞间(图2A)。黄色素细胞的体积(直径16.18±0.59 μm，n=75)显著性小于黑色素细胞(图3, P＜0.05)。在斑马鱼鳍中未观察到典型的虹彩细胞分布，但在鳍条中可见晶体状的类似鸟粪素颗粒分布(图2F)。

2.2 斑马鱼鳍中色素细胞的组成和分布

根据色素细胞分布情况，本文将斑马鱼鳍分为两类，I类无斑马纹的鳍，如背鳍、胸鳍和腹鳍(图4); II类斑马纹鳍, 如臀鳍和尾鳍(图5)。I类鳍细胞分布较分散，细胞间界限明显，以背鳍上色素细胞分布最为丰富。I类鳍远体端末梢主要为黄色素细胞，极少见有黑色素细胞分布，形成明显的色带。相对于I类鳍，II类鳍色素细胞数量多，细胞排列紧密，同类细胞聚集在一起并有规律的排列，整体观呈斑马纹图案，并于体侧的斑马条纹基本平行，其中尾鳍的条纹形状呈对称形状(图1、5)。斑马鱼五种鳍中同一种色素细胞在不同的鳍中大小存在明显差别, 特征最明显的是II类鳍中黄色素细胞体积显著大于I类鳍的黄色素细胞体积(图6，P＜0.05)。

图 2 斑马鱼鳍的色素细胞形态

2.3 斑马鱼鳞片细胞色素的种类和形态

斑马鱼鳞片上可观察到三种类型的色素细胞:黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞(图7)。斑马鱼鳞片中黑色素细胞数量最多，除有鳍中的两种形态外，还有两种形态。III类黑色素细胞为一种大小介于I类、II类之间，细胞体积较大(直径42.61 ±1.01 μm，n=45)，颜色较浅，棕褐色或藏青色，呈中等均匀密度的圆形(图7C); IV类较少见，细胞界限不清晰，呈云片状，颜色较浅，黑色素颗粒散在分布(图7D)。I、II、III类黑色素细胞大小差异显著(图8，P＜0.05)。鳞片中的黄色素细胞呈黄色，较少见橙黄色, 根据其形态可以分为: I类为小体积(直径10.68±0.46 μm，n=45)呈颗粒状的黄色素细胞(图7C)，在所有的色素细胞里体积最小(图8); II类为细胞体积较大(直径38.29±1.72 μm，n=45)，颜色较浅，呈散射状、弥散状或树突状(图7E、F)。虹彩细胞为长棒状或长梭状(长轴×短轴: 89.00±8.58 μm×16.43±1.75 μm，n=45)，个体最大(图8)，数量少，单独存在或成群紧密排列分布于鳞片上(图7G、H、I)。

2.4 斑马鱼鳞片上细胞色素分布特征

斑马鱼的鳞片可以分有色素细胞和无色素细胞两种。本文观察到有色素细胞鳞片的色素细胞分两层分布(图9A)，主要分布着黑色素细胞和黄色素细胞。从分布区域看，色素细胞主要分布在鳞片的顶区和侧区的末端(图9)，在鳞纹上一般无色素细胞或少量的黑色素细胞分布(图9A、I)。在两鳞片重叠部分的鳞沟上未见黑色细胞分布，鳞片的此区域一般为无色素细胞分布或者仅有少量黄色素细胞分布(图9B、F)。斑马鱼不同部位的鳞片上色素细胞的分布表现也不同: 背鳍基部鳞片色彩鲜艳，顶区有大量的黑色素细胞和黄色素细胞分布(图9B); 胸鳍和腹鳍基部鳞片多为透明不含色素细胞(图9C)或有少量虹彩细胞分布(图9D); 臀鳍基部鳞片分布的色素细胞介于背鳍和胸鳍之间，有少量的色素细胞分布，如黄色素细胞(图9E); 尾鳍基部鳞片上色素细胞分布丰富(图9F)，有部分鳞片仅有黑色素细胞(图9G)，也有一半仅黄色素细胞一半黑色素细胞的(图9H); 斑马鱼体侧上鳞片形态与尾鳍基部鳞片相似，色素细胞有不对称分布的(图9G)，亦有均匀地对称分布的(图9I)。

图 4 斑马鱼I类鱼鳍(背鳍、胸鳍和腹鳍)色素细胞的组成和分布

3 讨论

图 6 斑马鱼五种鳍中色素细胞大小差异分析

硬骨鱼是色素系统最复杂的脊椎动物，其体色具有最多元化的特质并取决于色素细胞的数量和种类[1,25]。鱼类色素细胞主要分布在皮肤中, 而鳍和鳞片是皮肤的衍生物, 广泛地分布着色素细胞[1,26]。目前对鱼类体色的研究主要集中在鳍和鳞片组织的色素细胞上。本文在斑马鱼体表观察到三种类型色素细胞: 黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞。不同种类的色素细胞其形态结构、色素色和呈色物质等优势不同[27]。斑马鱼上观察到的三类色素细胞分别会产生黑色素、黄蝶啶和反射的鸟嘌呤结晶。斑马鱼黑色细胞有两类主要形态: 一种为树突状明显、颜色较浅、体积较大的I类黑色素细胞，一种为树突状不明、显颜色较深、呈团状、个体较小的II类黑色素细胞，与鲫[1]、鲤[2]、曼龙鱼[28]等硬骨鱼体表黑色细胞形态相似。动物的黑色素可以分为呈黑色和褐色含氮的真黑素(eumelanin)和呈棕色有半胱氨酸等参与的棕黑素(phaeomelanin)[27]。Robert等[4]也将斑马鱼的黑色素细胞分为真黑素和棕黑素两种。将黑色细胞分为I类和II类是目前国内外研究人员广泛认同的分类方式, 未见更细的分类报道。因此, 本文在斑马鱼鳞片上观察到的III类和IV类黑色素细胞在广义上可以归入I类。虹彩细胞是一种独特的鱼类色素细胞类型, 结构上与其反射光线的功能相适应[29]。斑马鱼的虹彩细胞个体较长,呈长棒状或梭形, 仅分布在鳞片上。

图 7 斑马鱼鳞片中色素细胞形态特征

图 8 斑马鱼鳞片色素细胞大小差异分析

斑马鱼背部皮肤颜色较深呈蓝灰色，身体两侧的皮肤呈蓝色与银白色或金黄色纵纹相间排列，条纹的方向可能取决于环境因素[4]。斑马鱼体表显眼的斑马条纹图案是黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞三种不同类型的色素细胞通过细胞间的相互作用而形成，黑色素细胞和虹彩细胞通过缝隙连接可调节黄色素细胞的形态和密度，黄色素细胞则通过直接接触诱导黑色素细胞膜去极化，相同类型的色素细胞间相互作用决定其在条纹形成过程中的集体迁移方向[25,30]。本研究发现斑马鱼鳍和鳞片在色素细胞种类、组成和分布上存在着差异，与鲫鱼等情况相似[1]。从色素细胞的种类上看，斑马鱼的所有鳍均分布有黑色素细胞和黄色素细胞两种类型色素细胞，而鳞片上中分布有黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞三种类型色素细胞。从色素细胞数量和分布情况看，斑马鱼鳍具有独特的特征，本文首次将其分为两类: I类无斑马纹的鳍，如背鳍、胸鳍和腹鳍; II类斑马纹鳍，如臀鳍和尾鳍。总体上与其他鲤科鱼类[1](如鲫鱼)的鳍上色素细胞数量表现出从近体端到远体端逐渐减少变化的特点截然不同。斑马鱼体侧上鳞片形态与尾鳍基部鳞片相似，其色素细胞分布与鳞片处在条纹的位置有关，银白色或金黄色条纹上的部分为无色素细胞、少量黄色素细胞或虹彩细胞，蓝条纹上三种色素细胞均有分布并且数量丰富。

图 9 斑马鱼鳞片色素细胞的分布情况

综上所述，AB品系斑马鱼体表有黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞三种类型色素细胞分布，但鳍和鳞片在色素细胞组成和分布上存在着差异，鳞片中色素细胞的种类和形态特征较鳍中色素细胞更丰富。

[1] 易云海, 宋一舸, 杨舟, 等. 鱼鳍和鳞片色素组成的比较观察[J]. 激光生物学报, 2014, 23(1):77-82.

[2] 徐伟, 李驰陶, 曹顶臣, 等. 几种鲤鲫鳞片色素细胞和体色发生的观察[J]. 水生生物学报, 2007, 31(1):67-72.

[3] Rawls JF, Mellgren EM, Johnson SL. How the zebrafish gets its stripes[J]. Dev Biol, 2001, 240(2):301-314.

[4] Kelsh RN. Genetics and evolution of pigment patterns in fish [J]. Pigment Cell Res, 2004, 17(4):326-336.

[5] Howe K, Clark MD, Torroja CF, et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome [J]. Nature, 2013, 496 (7446):498-503.

[6] Brugman S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation[J]. Dev Comp Immunol, 2016, 64:82-92.

[7] Chavez MN, Aedo G, Fierro FA, et al. Zebrafish as an emerging model organism to study angiogenesis in development and regeneration[J]. Front Physiol, 2016, 7:56.

[8] Goldshmit Y, Sztal TE, Jusuf PR, et al. Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish[J]. J Neurosci, 2012, 32(22):7477-7492.

[9] Norton W, Bally-Cuif L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics[J]. BMC Neuroscience, 2010, 11(1): 90.

[10] Sipes NS, Padilla S, Knudsen TB. Zebrafish-As an integrative model for twenty—first century toxicity testing[J]. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews, 2011, 93 (3):256-267.

[11] Ali S, Champagne DL, Spaink HP, et al. Zebrafish embryos and larvae: a new generation of disease models and drug screens [J]. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews, 2011, 93(2):115-33.

[12] 实验动物疾病研讨会—传染性及常见疾病[EB/OL]. http:/ /www.calas.org.cn/html/zxbg/tzgg/20150415/2273.html, 20160825.

[13] Nisha Gaind.US grants for zebrafish studies on the rise[EB/ OL]. http://www.nature.com/news/us-grants-for-zebrafishstudies-on-the-rise-1.20391, 20160825.

[14] 李阔宇, 潘鲁湲, 孙永华. 斑马鱼资源的开发保藏与国家斑马鱼资源中心[J]. 中国实验动物学报, 2014, 22(6): 93-98,105.

[15] 何嘉玲, 刘静, 王天奇, 等. 斑马鱼的质量标准化[J]. 中国实验动物学报, 2014, 22(6):99-102.

[16] 初晓红, 濮俊毅, 姚一琳, 等. 斑马鱼肝脏胆管系统的研究[J]. 实验动物与比较医学, 2010, 30(3):167-173.

[17] 林金杏, 魏晓锋, 初晓红, 等. 斑马鱼肝脏三维结构虚拟系统的建立[J]. 实验动物与比较医学, 2012, 32(5): 390-395.

[18] Yao Y, Lin J, Chu X, et al. Fine structure, enzyme histochemistry and immunohistochemistry of liver in zebrafish[J]. Anat Rec, 2012, 295(4):567-576.

[19] 林金杏, 章琳俐, 姚一琳, 等. 斑马鱼肠道显微和超微结构的研究[J]. 畜牧与兽医, 2013, 45(3):60-66.

[20] Zhang L, Yang P, Liu Y, et al. Pre-spermiogenic initiation of flagellar growth and correlative ultrastructural observations on nuage, nuclear and mitochondrial developmental morphology in the zebrafish Danio rerio[J]. Micron, 2014, 66: 1-8.

[21] 陈微, 章琳俐, 杨平, 等. 斑马鱼端脑的微细形态与结构[J].水产学报, 2015, 39(3):371-380.

[22] Yamanaka H, Kondo S. In vitro analysis suggests that difference in cell movement during direct interaction can generate various pigment patterns in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(5):1867-1872.

[23] Fadeev A, Krauss J, Frohnhofer HG, et al. Tight Junction Protein 1a regulates pigment cell organisation during zebrafish colour patterning[J]. Elife, 2015, 4: e06545.

[24] Ceinos RM, Guillot R, Kelsh RN, et al. Pigment patterns in adult fish result from superimposition of two largely independent pigmentation mechanisms[J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2015, 28(2):196-209.

[25] Braasch I, Brunet F, Volff JN, et al. Pigmentation pathway evolution after whole-genome duplication in fish[J]. Genome Biol Evol, 2009, 1:479-493.

[26] 沈伟. 鱼类鳞片研究概况[J]. 江苏农业科学, 2011,39(3): 307-310.

[27] 刘晓东，陈再忠. 鱼类色素细胞及体色调控[J]. 水产科技情报, 2008, 35(1):13-18.

[28] 李小兵, 郑署明, 吴青. 曼龙鱼色素细胞的显微观察[J]. 四川动物, 2012, 31(4):538-541.

[29] 李凯彬, 常藕琴, 刘春, 等. 虹鳉透明突变的遗传特征及其组织学观察[J]. 动物学杂志, 2011, 46(5):16-23.

[30] Mahalwar P, Singh AP, Fadeev A, et al. Heterotypic interactions regulate cell shape and density during color pattern formation in zebrafish[J]. Biol Open, 2016, 5(11):1680-1690.

Microscopical Observation on Pigment Cells in Fins and Scales of Zebrafish

LIN Jin-xing, FENG Li-ping, HU Jian-hua, GAO Cheng
(Shanghai Laboratory Animal Research Center, Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo observe the composition, distribution and morphological characteristics of pigment cells in the fins and scales of zebrafish. Method The microstructure of pigment cells in the fins and scales of AB strain of zebrafish was observed by optical microscope.ResultsAll fins in zebrafish distributed melanophores and xanthophores, without iridophores. According to the distribution of the pigment cells, the zebrafish fins were divided into two types: with or without zebra stripes. There were melanophores, xanthophores and iridophores existed in scales. The melanophores were mainly divided into two types: type I was larger, obviously dendritic and light color; type II was smaller, nodular, dark color. Xanthophores were the smallest, yellow or orange yellow. Iridophores were a long rod like or fusiform, with smallest number.ConclusionThere were three types of pigment cells in the surface of zebrafish including melanophores, xanthophores and iridophores. The composition and distribution of pigment cells in the fins and scales were different. The types and morphological characteristics of pigment cells in the scales were more abundant than that in fins.

Zebrafish; Fin; Scale; Pigment cell; Melanophore; Xanthophore; Iridophore

Q954.5

A

1674-5817(2017)02-0094-08

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.003

2016-10-31

上海市科技发展基金实验动物研究项目(15140901000, 16140904300)

林金杏(1983-), 女, 博士, 副研究员, 研究方向: 实验用鱼质量控制及形态学研究。

E-mail: linjinxing83@163.com