Afp-cre-lacZ转基因小鼠的构建

顾晓雯, 孙瑞林, 费 俭

(1. 同济大学生命科学与技术学院, 上海 200092; 2. 上海南方模式生物科技股份有限公司, 上海 201203)

Afp-cre-lacZ转基因小鼠的构建

顾晓雯1, 孙瑞林2, 费 俭1

(1. 同济大学生命科学与技术学院, 上海 200092; 2. 上海南方模式生物科技股份有限公司, 上海 201203)

目的 研究甲胎蛋白(Afp)阳性细胞的增殖分化在组织生长修复，肿瘤发生过程中的作用，建立Afp-CreERT转基因小鼠细胞示踪系统。方法 采用DNA雄原核显微注射方法获得Afp-CreERT转基因小鼠，筛选出合适的品系后，使之与Rosa26-lacZ工具小鼠杂交，获得Cre/lacZ双阳性的Afp-cre-lacZ转基因小鼠。结果 显微注射后，共出生小鼠56只，经PCR鉴定Cre阳性小鼠共4只，阳性小鼠传代后各为一系。筛选内源性Afp表达与Cre表达相对符合的品系作为Afp-CreERT转基因小鼠品系建系。Afp-CreERT转基因小鼠与Rosa26-lacZ工具小鼠杂交，经PCR鉴定后获得Cre/lacZ双阳性的Afp-cre-lacZ转基因小鼠。经实时PCR，X-gal染色，免疫荧光染色鉴定后得到Afp-cre-lacZ转基因小鼠细胞示踪系统，同时证实该系统能够正确示踪Afp表达阳性的细胞，同时也能够应用于肝损伤小鼠模型中。 结论 成功构建了Afp-cre-lacZ转基因小鼠细胞示踪系统，为研究这类细胞的谱系发生提供了工具。

甲胎蛋白(Afp); 转基因小鼠模型; 细胞示踪

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, Afp)是由Afp基因编码的一种糖蛋白，属于血清白蛋白一类的蛋白家族。该蛋白于1956年自人类胚胎中首次被发现[1]。在胚胎发育过程中，Afp基因开放表达，并且合成具有重要功能的Afp[2]。但随着发育完成，Afp的表达量逐渐降低，出生2年后，血清中基本已经检测不到Afp[3,4]。成年以后的Afp的高表达往往与肿瘤密切相关[5]。在对肝脏肿瘤的临床诊断中，血清中Afp的含量甚至成为了一项重要指标[6,7]。在生物学方面，有研究[8]指出Afp基因的表达与肝癌细胞的增殖相关，是一种促癌基因。还有研究[9]显示，在一些肝癌细胞中，Afp基因的表达甚至与表观调控有关。由此可见，Afp与细胞的发育、增殖密切相关，针对其作用与机制的研究多有报道。然而从细胞角度来说，以Afp为细胞表面标记，针对Afp表达阳性的细胞类群的研究并不多见。在正常的成体组织器官中，是否还有Afp阳性细胞？如果有，那么这些细胞与胚胎期的Afp阳性细胞有何关联？在组织发育、损伤修复甚至是肿瘤形成的过程究竟扮演怎样的角色？这些问题目前还不明了。为了研究表达Afp表达阳性的这类细胞的功能，本文利用CreERT-loxP系统建立了以Afp基因表达为标志的小鼠细胞谱系活体模型，并在肝脏中，验证了这一模型的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性C57BL/6J小鼠, 8～12周龄，上海南方模式生物科技股份有限公司提供[SCXK(沪)2014-0002]，所有动物实验均在上海南方模式生物研究中心完成[SYXK(沪)2013-0035]。动物实验方案获得公司动物伦理委员会的批准。

1.2 试剂和实验仪器

PCR试剂盒 Taq PCR MasterMix、反转录试剂盒FastQuant RT Super Mix、Realtime PCR试剂盒SuperReal PreMix Plus SYBR Green、TRiZol购自北京Tiangen公司，GenenRuler1 kb DNA Ladder购自美国MBI Fermentas公司，他莫昔芬、玉米油、Nuclear Fast Red染料、硫酸铝钾十二水合物、六氰基亚铁酸钾三水合物、铁氰化钾、氯化镁六水合物、N,N-二甲基甲酰胺、IGEPAL、戊二醛、多聚甲醛购自美国Sigma公司，anti-lacZ、anti-AFP一抗、山羊抗鸡(goat Anti-Chicken) IgY H&L (Cy3)购自美国Abcam公司，山羊抗兔(goat anti-rabbit)(FITC) 二抗购自上海碧云天公司、其他常规化学试剂购自中国国药集团化学试剂有限公司。PCR 仪和Real-time PCR仪购自德国Eppendorf公司，光学显微镜90i购自日本Nikon公司，共聚焦显微镜Fv10i购自日本Olympus公司，冰冻切片机购自美国Thermo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 基因组鉴定 小鼠基因组提取: 小鼠出生后2周内, 剪取长约0.3 cm左右的鼠尾。加入400 μL裂解液(包含质量分数10% SDS、1 mol/L Tris、0.5 mol/L EDTA、5 mol/L NaCl以及40 μL蛋白酶K (10 mg/mL))。置于56 ℃杂交炉内, 消化过夜。离心取上清, 加入800 μL无水乙醇沉淀，沉淀用体积分数75%乙醇洗涤1次, 稍晾干后溶解于100 μL ddH2O中，4 ℃溶解过夜。获得小鼠基因组DNA。

PCR鉴定: 利用PCR试剂盒 Taq PCR MasterMix扩增鉴定片段, 反应体系参见说明书。反应条件为: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性20 s, 58 ℃退火30 s，72 ℃延长30 s, 变性至延长步骤共35个循环, 72 ℃延长10 min。PCR产物质量分数1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

引物序列:

1.3.2 实时定量PCR检测 小鼠颈椎脱臼处死之后取心、肝、脾、肺、肾和骨髓组织提取RNA。使用反转录试剂盒FastQuant RT Super Mix翻转成cDNA模板。使用Realtime PCR试剂盒SuperReal PreMix Plus SYBR Green检测RNA表达情况。

引物序列:

1.3.3 他莫昔芬诱导表达 配制20 mg/mL他莫昔芬/玉米油溶液；按小鼠体质量120 mg/kg剂量，隔日、腹腔注射给药，共给药5次，给药2周后进行后续实验。

1.3.4 组织标本处理以及冰冻切片 取小鼠肝脏组织，质量分数4%多聚甲醛4 ℃固定4 h，换质量分数15%蔗糖脱水过夜，换质量分数30%蔗糖脱水8 h，冰冻切片包埋剂(OCT)包埋组织后切片。切片厚度10 μm。

1.3.5 X-gal染色 取冰冻切片, 置于冰上, 2 mmol/L MgCl2/PBS洗2次，每次5 min，去除OCT。配置洗涤溶液(含质量分数0.02% NP-40以及2 mmol/L MgCl2)洗涤切片，后将切片置于X-gal染液，37℃染色过夜。次日，复染核快红，常规梯度脱水，透明后树脂封片，光学显微镜下观察。

1.3.6 免疫荧光染色 冰冻切片37 ℃复温30 min后，60 ℃烘箱烘干; 体积分数0.5%Triton/PBS洗2～3次，免疫组织化学封闭液封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，加入二抗以及DAPI常温孵育1 h，PBS洗3次后封片，置于激光共聚焦显微镜下观察。

1.3.7 肝损伤模型 参考2-乙酰氨基芴(2-Acetylaminofluorene, 2-AAF)给药辅以肝部分切除(Partial Hepatectomy，PH)手术联用的方法[10,11], 作者制作了小鼠肝损伤模型。具体实验方案为，10 mg/kg 2-AAF灌胃给药, 连续给药4 d; 第5日进行肝切除手术; 第6日, 第8日以120 mg/kg的剂量, 灌胃给他莫昔芬，共2次; 同时，手术后继续以10 mg/kg 2-AAF的剂量灌胃给药，每日一次，7 d后取小鼠肝脏组织，进行检测。

2 结果

2.1 Afp-CreERT转基因小鼠获得

转基因小鼠制备方式为小鼠受精卵细胞原核DNA显微注射。AFP质粒DNA(上海南方模式生物科技股份有限公司提供)用SacII酶切，凝胶回收酶切大片段(约24 kb)后进行小鼠受精卵细胞原核DNA显微注射(图1A、B)。显微注射出生56只小鼠于2周龄剪尾，抽提基因组DNA，经PCR, 筛选发现4只转基因阳性小鼠(图1C)。阳性小鼠和数只野生型小鼠再次剪尾抽提基因组DNA，双盲再次进行PCR检测，确认4只为转基因阳性小鼠，并作为首建者小鼠，其后代单独建系，即获得4个品系的待筛选Afp-CreERT转基因小鼠。

2.2 Afp-CreERT转基因小鼠Cre表达情况检测将4只首建者小鼠与野生型小鼠进行传代建系，取后代小鼠，检测其Cre表达情况，表明其中2系小鼠的Cre的RNA表达为阴性，故予以淘汰。另外2系小鼠中选择表达情况与内源Afp基因(e-Afp)表达谱更为接近的1系小鼠继续繁殖，作为Afp-CreERT转基因小鼠进行保留，另1系小鼠则淘汰(图1D)。

2.3 Afp-cre-lacZ转基因小鼠X-gal染色鉴定

将Afp-creERT转基因小鼠与Rosa26-lacZ工具小鼠杂交，获得Cre/lacZ双阳性的Afp-cre-lacZ品系的细胞示踪小鼠。取1月龄Afp-cre-lacZ品系小鼠，给予他莫昔芬诱导之后取其肝脏组织，进行X-gal染色鉴定。经过他莫昔芬诱导后，X-gal染色阳性细胞出现在肝脏内(图2)。

图 1 Afp-CreERT转基因小鼠品系鉴定Figure 1 Identification of Afp-CreERT transgenic mice

图 2 Afp-cre-lacZ转基因小鼠肝脏组织X-gal染色结果Figure 2 X-gal staining results of Afp-cre-lacZ mice liver

2.4 Afp-cre-lacZ转基因小鼠免疫荧光染色鉴定

为了检验肝脏X-gal染色阳性的细胞是否为Afp阳性细胞, 利用Afp以及lacZ抗体进行免疫荧光共定位的检测。检测结果显示，Afp与lacZ能够共定位(图3)。因此，Afp-cre-lacZ转基因小鼠示踪系统中, lacZ阳性细胞的确也是Afp阳性细胞。

2.5 Afp-cre-lacZ转基因小鼠在肝损伤模型中应用

图 3 Afp-cre-lacZ转基因小鼠肝脏组织中Afp与lacZ免疫荧光共定位Figure 3 Immunofluorescence co-localization of Afp and lacZ in Afp-cre-lacZ mice liver

为了鉴定Afp-cre-lacZ转基因小鼠在肝损伤或者疾病模型中是否也能够进行应用, 建立了2/3肝切除手术联合2-AAF给药的肝损伤模型。X-gal染色结果显示，在肝切除手术的伤口处，出现了X-gal染色阳性的细胞(图4)。表明Afp-cre-lacZ转基因小鼠示踪系统可以应用于肝损伤模型。

3 讨论

本文利用传统的DNA雄原核显微注射方法构建了Afp-cre-lacZ转基因小鼠。小鼠肝组织切片的X-gal染色与免疫荧光共定位的结果表明，在肝脏中，Afp-cre-lacZ转基因小鼠示踪系统能够正确示踪Afp表达阳性的细胞，同时也能够应用于肝损伤小鼠模型中。另外，实验结果也表明，在成体肝组织中，存在少量Afp表达阳性细胞。

近年来，对肝脏细胞的示踪研究报道[12-15]主要集中在干细胞、实质细胞以及胆管细胞的研究，并且对其增殖分化已经有了比较深入了解。由于Afp与胚胎发育以及肿瘤发生存在密切关联[16]，因此，在正常组织中Afp阳性细胞可能与干细胞相关，在肝癌中，则可能与肿瘤细胞相关。但是在胚胎、成年和疾病这3个时期, Afp阳性细胞之间的关联仍未知, 缺乏合适的动物模型是一个重要的原因。因此, 作者认为利用本文所构建的Afp-cre-lacZ转基因小鼠模型将有助于对Afp阳性细胞在生理和病理情况下的作用开展深入研究。

图 4 Afp-cre-lacZ转基因小鼠肝损伤模型X-gal染色结果Figure 4 X-gal staining result in 2-AAF/PH liver injury of Afp-cre-lacZ mice

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Construction of Afp-cre-lacZ Transgenic Mouse Model

GU Xiao-wen1, SUN Rei-lin2, FEI Jian1
(1. School of Life Science and Technology, Tongji University, Shanghai 200092, China 2. Shanghai Biomodel Organism Science & Technology Development Co.,Ltd., Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo study the function of alpha-fetoprotein (Afp) positive cells during tissues growth and repair or in tumorigenesis, Afp-cre-lacZ linage tracing mouse model was established.MethodsAfp-CreERT mice were established by microinjection and identified by real time PCR. Afp-CreERT mice were crossed with Rosa26-lacZ mice. Cre/lacZ both positive mice were kept as Afp-crelacZ mice.ResultsFifty-six transgenic mice were born after microinjection. Four of them genotyped Cre positive were kept as founder. Each founder was established a strain. Cre expression of each strain was identified via real time PCR. Thus Afp-CreERT transgenic mouse was established. The Cre/lacZ both positive offspring of Afp-CreERT mice were crossed with Rosa26-lacZ mice were kept as Afp-crelacZ mice. Identified by real time PCR, X-gal staining and immunofluorescence, Afp-cre-lacZ mice were observed that they could be used in lineage tracing and further studies.Conclusions The Afp-cre-lacZ mice established may be used as a tool for lineage tracing studies.

Alpha-fetoprotein (Afp); Transgenic mouse model; Lineage tracing

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0089-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.002

2017-02-05

国家重点基础研究发展计划(2010CB945501)

顾晓雯(1988-), 女, 博士, 从事生物化学与分子生物学研究。E-mail: 17guxiaowen@tongji.edu.cn

费 俭, 教授。E-mail: jfei@tongji.edu.cn