电针对短暂性脑缺血发作大鼠神经元形态学及细胞凋亡的影响

王 威,唐 伟,张 军,迟海涛

(1.大连大学附属中山医院，辽宁 大连 116001;2.大连大学附属新华医院,辽宁 大连 116021)

电针对短暂性脑缺血发作大鼠神经元形态学及细胞凋亡的影响

王 威1,唐 伟2△,张 军2,迟海涛2

(1.大连大学附属中山医院，辽宁 大连 116001;2.大连大学附属新华医院,辽宁 大连 116021)

目的：探讨电针对短暂性脑缺血发作大鼠神经元形态学及细胞凋亡的影响。方法：Wistar雄性大鼠32只随机分为正常对照组、假手术组、模型组、针刺组，每组8只。采用四血管阻断法建立短暂性脑缺血发作大鼠模型。正常对照组、假手术组、模型组不给予任何治疗。针刺组造模后给予电针治疗，术后1周取材。尼氏染色观察神经元损伤情况，透射电镜观察神经元超微结构；原位末端标记法检测(TUNEL染色)大脑皮质、海马CA1区神经元凋亡。结果：神经元尼氏染色结果:模型组染色较浅，神经元尼氏染色阳性细胞数较少。而电针组较模型组神经元尼氏染色阳性细胞数增多(P<0.05)。电镜观察结果:模型组大脑皮层、海马CA1区见神经细胞肿胀，核周间隙扩张或消失,染色质凝集成块或溶解，线粒体嵴断裂;电针组电镜下观察线粒体肿胀轻微，毛细血管水肿少见,胞浆内细胞器丰富，结构完整。细胞凋亡检测结果:正常对照组大脑皮层、海马CA1区假手术组凋亡阳性细胞较少见，模型组大脑皮层、海马CA1区可见较多凋亡细胞，针刺组与模型组比较，凋亡细胞明显减少，具有显著性差异(P<0.05)。结论：电针可以减轻短暂性脑缺血发作大鼠大脑皮层及海马CA1区神经元损伤，抑制神经元凋亡。

电针；短暂性脑缺血发作；细胞凋亡；超微结构

短暂性脑缺血发作(TIA)是脑血管病变引起的短暂性、发作性脑功能障碍，主要表现肢体功能障碍、语言障碍等，发作可持续数分钟至1 h，多在24 h内恢复，不遗留神经功能缺损症状和体征，是急性脑梗死最主要的危险因素之一，具有可逆性、反复性特点。发作越频繁，进展脑梗死可能性越大[1]。短暂性脑缺血发作具有一定脑损伤，能够引起短暂的认知障碍，核磁弥散加权成像的研究发现，超过30%的TIA患者脑内存在细胞毒性水肿[2]。研究表明电针治疗可以减轻TIA患者脑损伤，具有脑保护作用，但机理不明[3,4]。本研究利用全脑缺血TIA动物模型，从神经元形态学、脑组织超微结构及细胞凋亡角度探讨针刺治疗效应，研究其可能机制，为临床电针治疗短暂性脑缺血发作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

Wistar大鼠，雄性，清洁级，体质量为(230±30)g，购自大连医科大学动物中心[合格证编号为SY(辽)2013101]。动物饲养条件：SPF级，室温为20℃～25℃，湿度保持50%～60%，昼夜12 h明暗光照循环。实验大鼠32只，随机分为正常对照组、假手术组、模型组、电针组，每组8只，实验处置符合小动物伦理标准。

1．2 主要仪器及试剂

KWD-808Ⅱ型脉冲电疗仪(中国常州武进长城医疗器械有限公司)；JEM-1220型透射电子显微镜(日本电子公司)；OLYMPUS BH-2型显微光镜(日本电子公司)；BMJ-1型生物组织包埋机(天津天利航空机电有限公司)；Leiz型轮转切片机(德国Leica)； LKB-V超薄切片机(瑞典 LKB公司生产)；原位末端凋亡检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；一次性无菌针灸针(苏州针灸用品有限分司)。

1.3 模型制作方法

采用四血管阻断法建立短暂性脑缺血发作大鼠模型[5]。术前12 h禁食不禁水。腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉大鼠；碘伏消毒，铺无菌洞巾，在后颈背正中切1 cm长的切口，逐层分离组织，找到颈椎两侧横突孔，横突孔下为双侧椎动脉走行， 用直径0.5 mm电凝针插入横突孔约2 mm，致双侧椎动脉成永久闭塞， 观察无活动性出血，缝合切口；动物取仰卧，消毒颈前正中皮肤，在颈前正中切口，逐层分离皮下组织，钝性分离出双侧颈总动脉(CCA)，用丝线标记，注意保护迷走神经，双侧颈总动脉(CCA)同时用动脉夹夹闭缺血3 min，间隔60 min，再次给予3 min/次缺血，总共3次，制作大鼠短暂性脑缺血发作的动物模型。

1.4 干预方法

正常对照组：只作腹腔注射麻醉，不进行手术;假手术组：只进行模型组手术步骤，不发生双侧椎动脉、颈总动脉缺血，仅暴露4根血管;电针组：给予针刺治疗，造模后24 h后进行。

1.5 针刺穴位选择与针刺方法

百会：取穴双耳连线与正中线交点，位于颅顶骨正中；用0.25 mm×25 mm毫针，向后沿皮斜刺2 mm。曲池(双侧)：前肢桡骨近端，肘关节外侧前方的凹陷中;直刺进针4 mm，用0.25 mm×40 mm毫针。足三里( 双侧)：膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处;直刺进针5 mm，用0.25 mm×40 mm毫针。“百会”穴间歇5 min捻转1次，平补平泻。针刺每日1次，时间30 min，双侧 “足三里”“曲池”穴连接电疗仪，强度以肢体轻微抖动为度，频率1 Hz，电压2 V，治疗7天断头取脑。

1．6 取材及指标检测方法

1．6．1 灌注固定 麻醉后，将大鼠仰卧固定于固定架上，手术暴露心脏。用16号针头向左心尖刺入左心室，剪开左心耳，0.9%氯化钠注射液250 ml快速冲洗血液，再用4%多聚甲醛快速加压静推，直至使大鼠全身颜色变白，全身僵硬，尾巴翘起为止。

1．6．2 实验取材 双侧大脑迅速放入4%的多聚甲醛固定24 h后，用切刀前额极向后至枕极平分为5等份，取含有海马、皮层脑片，室温下经酒精梯度脱水，用石蜡包埋，以备切片。

1．6．3 尼氏染色观察神经元损伤 石蜡切片、片子厚度约为4 μm，裱于干净载玻片上，脱蜡，入预热60℃1%甲苯胺蓝40 min，蒸馏水洗3次，95%乙醇分化，脱色，至背景清楚为止，无水乙醇、二甲苯，封片显微镜下观察大脑皮层与海马CA1区尼氏染色阳性神经元数目。

1．6．4 原位末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡 每只大鼠取相同部位连续切片5张，实验步骤按原位末端凋亡检测试剂盒说明书进行操作，在显微镜下(10×40倍)对大脑皮层、海马CA1区凋亡阳性细胞进行计数，凋亡神经细胞标志为细胞核中有棕黄色颗粒者。

1.6.5 电子显微镜下观察脑组织超微结构的变化 每组取2只大鼠，腹腔注射麻醉，暴露心脏，先灌注生理盐冲洗血液，再灌注3%戊二醛，取脑，分离并留取额叶皮层与海马CA1区， 在1 min内投入2.5%戊二醛固定液4℃固定，四氧化锇固定，逐级丙酮脱水，Epon812包埋液，半薄切片，定位后，超薄切片，切片捞在有支持膜的载网上，脱水至70%乙醇，丙酮配制的饱和醋酸铀溶液中染色时间2 h，电子显微镜下观察神经元超微结构。

1．7 统计学处理

2 结果

2.1 实验大鼠体质量、手术时间及手术肛温比较

为了除外环境因素影响，笔者对实验中大鼠体质量、手术时间及手术肛温进行了比较，结果表明各组无显著性差异(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量、手术时间及手术肛温比较

2.2 神经元尼氏染色结果

正常对照组、假手术组大脑皮层、海马CA1区神经元尼氏体丰富，神经元尼氏染色阳性细胞数较多。模型组神经元丢失明显，染色较浅，神经元尼氏染色阳性细胞数目明显较少。而电针组较模型组神经元尼氏染色阳性细胞数增多，有显著性差异(P<0.05)。见表2。

表2 神经元尼氏染色阳性细胞数比较 (个)

注：与模型组比较,*P<0.05

2.3 电镜观察结果

①大脑皮层、海马CA1区正常对照组、假手术组神经元细胞核呈卵圆形,线粒体呈椭圆形、圆形，线粒体嵴清晰可见，胞浆内细胞器丰富，结构完整,见图1，可见高尔基体分布。②模型组大脑皮层、海马CA1区见神经细胞肿胀，核膜内陷，锯齿样变，线粒体嵴断裂，染色质凝集成块或溶解,见图2，核周围细胞器减少、消失见图3。③电针组大脑皮层、海马CA1区电镜下观察毛细血管轻微水肿见图1,线粒体稍肿胀，未见有核膜内陷，线粒体嵴结构完整,见图4，胞浆内细胞器丰富，结构完整。

图1 电针组海马CA1区 TEM×30000

图2 模型组海马CA1区 TEM×12000

图3 模型组大脑皮层TEM×30000

图4 电针组大脑皮层TEM×30000

2.4 细胞凋亡检测结果(TUNEL染色)

大脑皮层、海马CA1区模型组可见大量凋亡阳性细胞。正常对照组、假手术组大脑皮层、海马CA1区凋亡阳性细胞少见。电针组凋亡阳性细胞数目较模型组明显减少，模型组与电针组比较有显著性差异(P<0.05)。见表3。

表3 凋亡阳性细胞数比较 (个)

注：与模型组比较*P<0.05

3 讨论

TIA患者发生卒中的概率明显高于一般人群，7天内发生卒中的风险为4%～10%,为中风先兆，与中医文献中记载的“小中风”极为相似。中医认为病因病机主要为气虚血瘀，肝阳上亢，痰湿阻络，脑络瘀阻[6]。

本研究选取穴位，百会为督脉经穴，位居巅顶，有祛风醒脑、宣闭开窍、升提阳气功效,对整个经络系统有统帅作用。曲池穴、足三里均是阳明经合穴，阳明气血旺盛，“正气存内，邪不可干”[7]，百会、曲池穴、足三里诸穴合用具有醒脑开窍、协调阴阳、疏通经络之功效。

脑组织几乎无葡萄糖和氧储备，对缺血缺氧十分敏感，不同部位对缺氧敏感性不同，大脑皮质(第3、4层)、海马CA1区神经元最为敏感[8]，这是本实验选取这二个部位作为研究对象的原因。正常对照组、假手术组大脑皮层、海马CA1区尼氏染色神经细胞排列整齐紧密，形态完整，尼氏体丰富。电镜下大脑皮层、海马CA1区神经元细胞器丰富，核内染色质均匀分布，核膜结构清晰光滑，说明了手术创伤与麻醉药对脑组织形态学没有改变。模型组光镜下尼氏染色可见神经细胞数目减少，尼氏体减少。电镜下可见神经细胞轮廓模糊，细胞固缩或肿胀，核膜内陷，锯齿样变。说明了短暂性脑缺血发作对脑组织有一定损伤[9]。而电针组光镜下尼氏染色示神经元数目较多，尼氏体较丰富，电镜下毛细血管水肿少见，线粒体肿胀轻微，结构完整，说明电针对短暂性脑缺血发作具有一定保护作用，能减轻缺血后神经元损伤。

细胞凋亡是细胞核在一定条件下，通过内源DNA内切酶的激活，启动其自身内部机制，导致细胞死亡的过程。短暂性脑缺血发作神经元缺血程度并非是完全性脑缺血，而是一个短暂反复多次缺血的过程，因此局部神经元的死亡方式不是一种急性坏死，而是一种缓慢发生的程序化过程——凋亡。本实验TUNEL法检测大脑皮层、海马CA1区神经元凋亡，正常对照组、假手术组见少许凋亡阳性细胞，模型组可见较多凋亡阳性细胞，表明细胞凋亡是短暂性脑缺血发作脑损伤一种方式。电针组大脑皮层、海马CA1区凋亡阳性细胞较模型组明显减少，此结果说明电针可以减轻短暂性脑缺血发作脑损伤，减少神经元凋亡，从而证实抑制短暂性脑缺血发作大鼠神经元凋亡，可能是电针发挥脑保护作用的一种途径，其机制有待进一步探讨。

[1] 饶明俐．中国脑血管病防治指南[J]．中风与神经疾病杂志，2006，23(1)：4-8

[2] Rooij FG，Schaapsmeerders P，Maaijwee NA，et al．Persistent Cognitive Impairment after Transient Ischemic Attack[J]．Stroke,2014，45(8)：2270-2274

[3] 王玲.针刺治疗短暂性脑缺血发作及对血液动力学的影响[J]．针灸临床杂志,2007，23(6)：3-4

[4] 苏云海，麻红．针刺治疗短暂性脑缺血发作的临床观察[J]．针灸临床杂志,2007，23(7)：14-15

[5] 李军杰，张致身．短暂性脑缺血发作后海马区星形胶质细胞形态学研究[J]．首都医科大学学报，1998(19)：323-326

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Effect of Electroacupuncture on the Morphology and Apoptosis of Neurons in Rats with Transient Ischemic Attack

WANG Wei1,TANG Wei2△,ZHANG Jun2,CHI Hai-tao2

(1.TheAffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian116001,China;2.TheAffiliatedXinhuaHospitalofDalianUniversity,Dalian116021,China)

Objective：To investigate the effect of electroacupuncture on the morphology and apoptosis of neurons in rats with transient ischemic attack.Methods：Thirty-two male Wistar rats were randomly divided into a normal control group,a sham operation group,a model group and an acupuncture group, with 8 rats in each group. A rat model of transient ischemic attack was established by four vessel occlusion. Normal control group, sham operation group and model group were not given any treatment, and electroacupuncture group was given electroacupuncture treatment. Nissl bodies were observed by Nissl's staining. The ultrastructure of neurons was observed by the electron microscope, and neuronal apoptosis was detected by in situ cell apoptosis (TUNEL staining) in the cerebral cortex and hippocampus CA1 area.Results：The number of positive cells in the electroacupuncture group was more than that in the model group (P<0.05). The result of electron microscope showed that swelling of the nerve cells, the expansion or disappearance of the nuclear gap, chromatin condensation into blocks or dissolution and mitochondrial crest fracture were found in the cerebral cortex, hippocampal CA1 area in the model group. But slight swelling of mitochondria and capillary edema, abundant and complete structure of cytoplasmic organelles were found in electroacupuncture group. TUNEL staining showed that apoptosis cells were rare in the cerebral cortex and hippocampus CA1 area in the normal control group and sham operation group. Compared with the model group, the apoptosis cells in the electroacupuncture group were reduced, and there was a significant difference between two groups (P<0.05).Conclusion：Electroacupuncture can allieviate neuronal damage and inhibit neuronal apoptosis in cerebral cortex and hippocampus CA1 area in rats with transient ischemic attack.

Electroacupuncture;Transient ischemic attack;Apoptosis;Ultrastructure

王威(1979-)，女，副主任医师,主要从事中医针灸研究。

△通讯作者：唐伟(1972-)，男，主任医师，主要从事神经内科研究。

R246.6

A

1005-0779(2017)04-0061-04

2016-10-26