敲除pknG提高谷氨酸棒杆菌L-谷氨酸和GABA产量

王楠楠， 倪亚兰， 史 锋*

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122；3.江南大学 食品安全与营养协同创新中心，江苏 无锡214122）

敲除pknG提高谷氨酸棒杆菌L-谷氨酸和GABA产量

王楠楠1，2，3， 倪亚兰1，2，3， 史 锋*1，2，3

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122；3.江南大学 食品安全与营养协同创新中心，江苏 无锡214122）

γ-氨基丁酸（GABA）具有多种生理功能，被广泛应用于食品、医药等行业。在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中表达来自短乳杆菌的两个谷氨酸脱羧酶（GAD）编码基因gadB1、gadB2，可将其自身积累的L-谷氨酸有效转变成GABA。为了进一步提高GABA产量，首先在ATCC13032中敲除了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknG的编码基因pknG，以提高GABA的前体物质L-谷氨酸的供应，然后将GAD表达质粒pJYW-4-gadB1-gadB2转入pknG敲除菌株和ATCC13032中，构建出重组菌SNW203和SNW200，最后对两个重组菌进行上罐发酵。结果表明：相对于SNW200，菌株SNW203的L-谷氨酸和GABA产量都有所提高。发酵72 h后，GABA产量为（30.2±0.3）g/L，相对于SNW200提高了55.4%，L-谷氨酸和GABA的总摩尔浓度为0.3 mol/L，提高了36.4%。这说明敲除pknG能够促进重组谷氨酸棒杆菌的L-谷氨酸和GABA生物合成。

γ-氨基丁酸；谷氨酸棒杆菌；pknG基因

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统一种重要的抑制性神经递质，具有降血压、镇静安神[1]、健肝利肾、调节激素分泌[2]、抑制癌症等功能。因此，GABA作为一种功能性因子被广泛应用于食品、医药等行业。GABA是由谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD）催化L-谷氨酸发生α-脱羧反应生成的。几种细菌GAD基因已被确定，比如大肠杆菌 （Escherichia coli）和乳酸菌 （Lactic acid bacteria，LAB）。LAB是对人类和动物有益的益生菌群，因此是最适合生产GABA的微生物[3]。然而，通过LAB生产GABA需要添加L-谷氨酸作为前体物质，并且LAB的培养需要昂贵的氮源。

谷氨酸棒杆菌 （Corynebacterium glutamicum），是一种好氧型的、非致病革兰氏阳性菌，它是一种重要的工业微生物，用来发酵生产L-谷氨酸和其它氨基酸[4]，及其它各种有机酸[5]。C.glutamicum中不存在GAD基因，在简单的培养基中就能生长，相对于LAB的培养，成本很低。本课题组前期在C.glutamicum ATCC13032共表达了两个GAD基因（gadB1和gadB2），摇瓶发酵84 h时，GABA产量达到了（18.7±2.1）g/L[6]。L-谷氨酸转化为GABA的转化率达到了0.60 mol/mol。为了进一步提高GABA的产量，作为GABA的唯一的前体物质L-谷氨酸的合成必须加强。

C.glutamicum中，L-谷氨酸是由谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）催化α-酮戊二酸（α-Ketoglutarate，α-KG）直接合成的，但是α-酮戊二酸脱氢酶复合体 （α-Ketoglutarate dehydrogenase complex，ODHC）也会催化α-KG生成琥珀酰辅酶A，因此减少了L-谷氨酸合成的代谢流。而pknG会影响ODHC的活性，具体作用机制如图1。

图1 ODHC的亚基组成和OdhI、PknG对ODHC活性的调控Fig.1 ODHC subunits and the regulation of ODHC activity by OdhI and PknG

ODHC由三个亚基（图1）组成：α-酮戊二酸脱氢酶 （E1亚基，OdhA）、二氢硫辛酰琥珀酰转移酶（E2亚基，AceF）、二氢硫辛酸脱氢酶（E3亚基，Lpd）[7]。OdhI（α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂）是E1亚基OdhA的一个抑制蛋白质，非磷酸化的OdhI可以与OdhA相互作用，从而抑制ODHC的活性。而丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknG催化OdhI磷酸化而使OdhI失活[8]，所以敲除PknG的编码基因pknG会降低ODHC的活性，从而有利于L-谷氨酸的合成。为此对pknG基因进行敲除，研究它对重组菌GABA及其前体物质L-谷氨酸合成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和引物 本研究中用到的菌株和质粒见表1，引物见表2。

1.1.2 培养基和培养条件

1）培养E.coli时均用LB培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10；筛选转化子需加入30 mg/L卡那霉素。

表1 本研究中所使用的菌株和质粒Table 1 Strains and plasmids in this research

表2 本研究中用到的引物Table 2 Primers in this research

2）C.glutamicum用LBG培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，葡萄糖5。

3）C.glutamicum感受态培养基 （g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，吐温80 1，甘氨酸30。

4）C.glutamicum电转化恢复培养基LBHIS（g/ L）：酵母膏2.5，蛋白胨5，氯化钠5，脑心浸液18.5，山梨醇91；筛选转化子需加入30 mg/L卡那霉素或者15 mg/L氯霉素。

5）C.glutamicum工程菌发酵种子培养基（g/L）：葡萄糖 25，玉米浆 30，尿素 8，K2HPO4·3H2O 1，MgSO40.2；卡那霉素30 mg/L；pH 7.2。

6）C.glutamicum工程菌发酵培养基（g/L）：葡萄糖100，玉米浆2，尿素4，K2HPO4·3H2O 2，MgSO40.4，MnSO4·7H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.29；卡那霉素30 mg/L，pH 7.2。

1.1.3 工具酶和主要试剂 各种限制性内切酶，rTaq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，DNA Ladder Marker，购自Fermentas公司公司；核酸染料GoldView，购于上海赛百盛基因技术有限公司；OPA，GABA标样，购于Sigma公司；蛋白胨，酵母膏，脑心浸液，购于英国OXOID公司；色谱纯乙腈，甲醇，0.22 μm有机相和水相滤膜，购于上海安普科学仪器有限公司；其它试剂均购于国药集团上海化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pknG敲除菌株的构建 基因的敲除采用谭延振[12]和Hu等[9]报道的方法，原理是基于同源重组和位点特异性重组。首先，在E.coli JM109中构建pknG基因的敲除质粒，再转入 C.glutamicum ATCC13032中，使其发生同源重组从而敲除目的基因，然后转入携带cre基因的质粒使位于kan片段两端的lox位点发生位点特异性重组，从而去除kan片段，最后去除携带cre的质粒，进而得到pknG敲除菌株。E.coli JM109和C.glutamicum感受态细胞制备方法和转化方法参照Xu等[13]报道的方法。

1）pknG敲除质粒的构建过程：pknG敲除质粒的构建过程如图2所示：首先，以C.glutamicum ATCC13032的基因组为模板，pknGU-F/pknGU-R（5’-3’端引入的酶切位点是：Hind III和Xho I）和pknGD-F/pknGD-R（酶切位点是：Xba I和Kpn I）这两对引物，分别PCR扩增出pknG基因的上游同源臂片段pknGU和下游同源臂片段pknGD。其次，以质粒pDTW-202为模板，kanL-F/kanL-R（酶切位点是：Xho I和Xba I）为引物，扩增出kan基因片段，片段两端含有被Cre酶识别的lox位点。最后将pknG基因的上下游片段、kan片段和相应酶切过的pBluescript II SK的质粒连接，得到的新质粒即是pknG基因敲除质粒，命名为pSNW3。

2）pknG敲除菌株的构建过程：

①将敲除质粒pSNW3电转入C.glutamicumATCC13032，涂布于含有卡那霉素的恢复培养基 LBHIS平板上，30℃培养3 d左右。

图2 pknG基因敲除质粒pSNW3的构建过程Fig.2 Construction of pknG gene deletion plasmid pSNW3

②挑取平板上的转化子培养并进行PCR验证，选取验证正确的转化子，即同源重组后基因组带有kan基因片段的菌株，kan两端带有可以被Cre酶识别的lox位点。对此菌株进行感受态细胞的制备。

③为了去除基因组上的kan基因，把质粒pDTW109电转入上述感受态细胞中，此质粒是带有Cre酶的温敏型质粒，在37℃会丢失。然后涂布于含有氯霉素的恢复培养基LBHIS平板上，25℃培养一段时间至转化子长出，使基因组上的kan两端发生位点特异性重组。

④选取平板上的转化子进行PCR验证，挑取转化子验证kan基因片段是否去除，如果kan已经去除，将其接种于液体LBG培养基，37℃过夜培养，去除质粒pDTW109。

⑤挑取过夜培养的菌液于LBG固体划线，30℃培养24 h后挑取单菌落进行PCR验证和抗性验证。PCR验证正确并且在含有卡那霉素或者氯霉素的平板上均不生长的即为pknG敲除菌株，命名为SNW103。

1.2.2 GAD表达菌株的构建 gadB1和gadB2是编码GAD的两个基因，研究表明[10]，基因gadB1-gadB2的共表达比两个基因的单独表达更有利于GABA的积累。

对pknG敲除菌SNW103和野生型ATCC13032进行感受态细胞制备，将携带卡那霉素抗性基因的GAD表达质粒pJYW-4-gadB1-gadB2[11]分别转入两个菌株。构建GAD表达菌SNW103/pJYW-4-gadB1-gadB2，命名为SNW203；ATCC13032/pJYW-4-gadB1-gadB2，命名为SNW200。

1.2.3 C.glutamicum工程菌株的上罐发酵C.glutamicum工程菌株的上罐发酵方法参照Wang等[11]报道的方法。发酵周期为72 h，每隔12 h取样一次，待发酵结束后，用高压液相色谱（HPLC）测定各个时间点的L-谷氨酸和GABA的产量。

1.2.4 发酵过程中残糖和氨基酸含量测定 残糖：发酵过程中取出的发酵液离心取上清液，用ddH2O稀释100倍后直接用生物传感分析仪测定葡萄糖的质量浓度。

氨基酸含量测定：氨基酸含量测定方法是邻苯二甲醛（OPA）自动柱前衍生化法[10]。

2 结果与讨论

2.1 敲除pknG的GAD菌的构建

首先，构建pknG敲除质粒pSNW3，构建过程如1.2.1所述。随后将pknG敲除质粒pSNW3转入C.glutamicum ATCC13032进行同源重组，使抗性标记基因kan与pknG基因进行替换。然后通过Cre酶识别的lox位点进行位点特异性重组，去除抗性标记基因kan，得到pknG敲除菌株SNW103。构建过程如1.2.1所述。对构建得到的敲除菌株基因组进行PCR验证，以GU/GD（上游同源臂和下游同源臂中间位置设计的引物）为引物，产物大小为1 000 bp左右，如图3的1泳道。图3的2泳道是对野生型ATCC13032基因组PCR得到的产物，大小为2 581 bp，是pknG基因未敲除的大小。对比可以得出，pknG基因敲除成功。

图3 敲除菌株SNW103和野生型ATCC13032基因组PCR验证电泳图Fig.3 Verification of the deletion strain SNW103 and wild type ATCC13032 by PCR

最后将GAD共表达质粒转入pknG敲除菌株SNW103和ATCC13032中，得到pknG敲除GAD菌SNW203和野生型GAD菌SNW200。

2.2 pknG敲除GAD菌SNW203和野生型GAD菌SNW200的上罐发酵

分别对菌株SNW203和SNW200进行上罐发酵。

2.2.1 发酵过程的控制 在L-谷氨酸和GABA合成过程中，GDH（最适pH为7.5）和GAD（最适pH为4.5）是非常重要的两个酶。为了使这两个酶发挥活性，必须将发酵过程控制为两个不同pH阶段。0～36 h，L-谷氨酸发酵阶段；36～72 h，GABA合成阶段。

在发酵前期0～36 h，发挥作用的主要是GDH，L-谷氨酸大量合成。在发酵起始时，添加4 g/L的尿素作为氮源来维持菌体的生长，这时，pH会上升，所以流加2 mol/L HCl来控制pH值在7.0～7.5之间；当pH开始下降时，流加质量浓度10 g/dL尿素控制pH值在7.0～7.5之间，同时提供了L-谷氨酸合成时所需要的氮源。

在发酵后期36～72 h，发挥作用的主要是GAD，GABA大量合成。36 h之后，停止添加尿素，L-谷氨酸的积累量达到了很高，这时，pH会下降。当pH降到适合GAD发挥活性的值时，GAD开始发挥作用，L-谷氨酸开始转化成GABA，这时pH又会升高。要使GAD充分发挥活性，pH要维持在5.0～5.5之间，所以流加2 mol/L HCl来控制pH值。

发酵周期72 h，种子转接体积分数是8%，发酵在装有1.2 L发酵培养基的3 L NBS罐中进行，温度30℃，溶氧控在体积分数30%，转速和溶氧偶联。每隔12 h取样，分别测定OD562、残糖、L-谷氨酸和GABA产量。

2.2.2 发酵过程中OD562、残糖以及耗糖的变化 发酵过程中，菌株SNW203和SNW200的OD562变化情况如图4所示。0～12 h是菌体快速生长的时期，24 h之后缓慢增长，36～72 h基本平稳，但稍有下降。发酵72 h结束时，SNW203的OD562稍高于菌株SNW200，说明pknG基因敲除后没有影响菌体的生长。

图4 SNW203和SNW200的生长Fig.4 Growth of SNW203 and SNW200 cells

菌株SNW203和SNW200发酵过程中的残糖和耗糖情况见图5。

图5 菌株SNW203和SNW200的残糖和耗糖变化Fig.5 Residual glucose and glucose consumption of SNW203 and SNW200

从残糖变化来看，0～24 h，葡萄糖被快速消耗，此过程是菌体快速生长和L-谷氨酸快速合成时期，所以葡萄糖消耗很快。24 h之后，如果残糖小于20 g/L，则需要补加葡萄糖使其维持在20 g/L以上。24～36 h，葡萄糖消耗比较缓慢，主要用于L-谷氨酸的合成。36～72 h之间，葡萄糖消耗得很少，这个过程主要是L-谷氨酸转化成GABA的过程，所以耗糖比较少。发酵72 h结束时，菌株SNW200的总耗糖为 （112.7±7.5）g/L，菌株SNW203的总耗糖为（135.1±10.2）g/L，比菌株SNW200高出19.9%。

2.2.3 发酵过程L-谷氨酸和GABA的产量以及总浓度的变化 发酵过程中，菌株SNW203和SNW200的L-谷氨酸和GABA的产量变化如图6所示。两个菌株L-谷氨酸和GABA的积累趋势是相似的，但是产量相差很大。在对照菌株SNW200中，0～36 h，L-谷氨酸大量积累，36 h到达最高值（34.7±5.8）g/L，随后缓慢下降。36 h之后，L-谷氨酸开始转化成GABA，GABA开始积累，到72 h发酵结束时，GABA的最终产量为（19.4±2.6）g/L。最终L-谷氨酸转化成GABA的摩尔转化率达到了88%。在pknG敲除GAD菌SNW203中，0～36 h，L-谷氨酸大量积累，36 h到达最高值（44.8±5.3）g/L，随后迅速下降，L-谷氨酸的最高产量比菌株SNW200的最高产量高了29.2%。36 h之后，L-谷氨酸开始转化成GABA，GABA开始积累，72 h发酵结束后，GABA的最终产量为（30.2±0.3）g/L，比SNW200高出55.4%。最终L-谷氨酸的摩尔转化率为96%。

图6 菌株SNW203和SNW200的L-谷氨酸和GABA浓度变化Fig.6 L-glutamateand GABA concentrationsof SNW203 and SNW200

菌株SNW203和SNW200的L-谷氨酸和GABA的总摩尔浓度的变化如图7所示。

图7 SNW203和SNW200的L-谷氨酸和GABA总浓度变化Fig.7 Total concentration of L-glutamate and GABA of SNW203 and SNW200

在对照菌株SNW200中，0～36 h，L-谷氨酸和GABA的总摩尔浓度在不断升高，36 h达到最高值0.26 mol/L，随后有所降低，72 h发酵结束后，L-谷氨酸和GABA的总摩尔浓度是0.22 mol/L，GABA的糖酸转化率达到了0.33 mol/mol。

在pknG敲除GAD菌SNW203中，0～36 h，L-谷氨酸和GABA的总摩尔浓度在不断升高，48 h达到最高值0.32 mol/L，随后有所降低，发酵72 h结束时，L-谷氨酸和GABA的总摩尔浓度是0.30 mol/L，相对于SNW200提高了36.7%，发酵过程中的总摩尔浓度始终比SNW200高。GABA的糖酸转化率达到了0.39 mol/mol。

综上所述，敲除pknG基因后，有利于L-谷氨酸和GABA的积累。

另外，从图 6中可以看出，36～48 h，菌株SNW203的L-谷氨酸是迅速下降，而GABA是迅速升高，上升和下降的速度高于对照菌株SNW200。并且在48 h，绝大部分的L-谷氨酸已经转化成了GABA，转化速度非常快。因此在发酵过程中，可以进一步考虑缩短菌株SNW203的发酵周期，这样更有利于GABA的工业化生产。

3 结语

在C.glutamicum ATCC13032中共表达了两个GAD基因（gadB1和gadB2），可以有效地将其自身合成的L-谷氨酸转化为GABA。为了进一步提高GABA的产量，作为GABA的唯一的前体物质L-谷氨酸的合成必须加强。因此本研究中敲除pknG基因，来提高L-谷氨酸的供应，进而提高GABA的产量。首先，构建了pknG敲除菌株SNW103，然后将共表达GAD质粒转入SNW103和ATCC13032，得到pknG敲除GAD菌SNW203和对照GAD菌SNW200。

两个GAD菌株的上罐结果表明，pknG敲除后，GABA的产量从（19.4±2.6）g/L提高到（30.2±0.3）g/L，提高了55.4%。L-谷氨酸的最高产量从（34.7±5.8）g/L提高到（44.8±5.3）g/L，提高了29.2%。发酵结束后，L-谷氨酸和GABA的总摩尔浓度从0.22 mol/L提高到0.30 mol/L，提高了36.4%。可以看出，敲除pknG基因后，GABA和L-谷氨酸的产量都有所提高，pknG基因的敲除起到了很好的效果。

72 h发酵结束后，pknG敲除GAD菌SNW203的GABA产量有很大幅度的提高，L-谷氨酸摩尔转化率为96%，更有利于后期GABA的分离和纯化，为其工业化应用奠定了良好基础。

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Deletion of pknG Improves the Production of L-Glutamate and GABA in Recombinant Corynbacterium glutamicum

WANG Nannan1，2，3， NI Yalan1，2，3， SHI Feng*1，2，3
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Gama（γ）-aminobutyric acid（GABA），which has a variety of physiological functions，is widely used in food，pharmaceutical and other industries.Two L-glutamate decarboxylase（GAD）genes （gadB1 and gadB2）were co-expressed previously in an L-glutamate producing strain Corynebacterium glutamicum ATCC13032，making the own accumulated L-glutamate be effectively transformed into GABA.To further enhance GABA production，the pknG gene encoding serine/threonine protein kinase PknG was deleted to improve the supply of GABA precursor L-glutamate.Then the co-expression plasmid pJYW-4-gadB1-gadB2 was transformed into pknG deletion strain and ATCC13032，generating the recombinant C.glutamicum strains SNW203 andSNW200.After the strains were fermented in fermenters，the production of both L-glutamate and GABA in SNW203 increased greatly when compared with SNW200.At 72 h of fermentation，GABA production in SNW203 increased to（30.2±0.3）g/L，55.4%higher than that in SNW200 and the total concentration of L-glutamate and GABA reached up to 0.3 mol/L，36.4%higher than that in SNW200.This result indicates that the deletion of pknG improves the biosynthesis of L-glutamate and GABA in recombinant C.glutamicum.

γ-aminobutyric acid，Corynbacterium glutamicum，pknG gene

Q 815

A

1673—1689（2017）02—0187—07

2015-04-16

食品科学与技术国家重点实验室自主科研课题项目（SKLF-ZZB-201405）。

*通信作者：史 锋（1970—），女，江苏丹阳人，工学博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事微生物代谢工程与基因工程研究。

E-mail：shifeng@jiangnan.edu.cn

王楠楠，倪亚兰，史 锋.敲除pknG提高谷氨酸棒杆菌L-谷氨酸和GABA产量[J].食品与生物技术学报，2017，36（02）：187-193.