实验性自身免疫性重症肌无力模型大鼠腓肠肌低密度脂蛋白受体相关蛋白4表达的特点

闫斌，朱明振，李卫君，霍颖浩

实验性自身免疫性重症肌无力模型大鼠腓肠肌低密度脂蛋白受体相关蛋白4表达的特点

闫斌，朱明振，李卫君，霍颖浩

目的 探讨实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)模型大鼠腓肠肌低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)表达的特点。方法 将30只大鼠随机分为EAMG组、对照组和空白组。以小鼠乙酰胆碱受体(AChR)基因为模板合成AChR抗原，以Lewis大鼠为免疫动物。EAMG组采取主动免疫法将AChR抗原与弗氏佐剂混合制成乳剂，注射入大鼠背部皮下。对照组在相同部位注射等量的弗氏佐剂。空白组在相同部位注射等量的生理盐水。8周后使用低频重复电刺激(RNS)检测肌电RNS衰减率。采用蛋白免疫印迹法检测腓肠肌LRP4含量。结果 EAMG组所有大鼠在8周后出现肌无力症状，对照组、空白组大鼠无肌无力症状。EAMG组大鼠RNS衰减率明显高于对照组和空白组(均P<0.05)。EAMG组大鼠腓肠肌LRP4蛋白的相对含量明显低于对照组和空白组(均P<0.05)。结论 EAMG大鼠中，当AChR被自身抗体破坏时，可能导致包含LRP4在内的整条信号通路受损，进而使LRP4含量减少。LRP4是神经肌肉接头信号通路完整的重要分子。

低密度脂蛋白受体相关蛋白4；重症肌无力；主动免疫；乙酰胆碱受体

重症肌无力(MG)是一种主要由乙酰胆碱受体(AChR)抗体介导的发生在神经肌肉接头(NMJ)处的自身免疫性疾病[1]。低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)属于LDLR跨膜蛋白家族成员之一[2]，主要分布于脑组织、骨骼、神经肌肉接头突触后膜。LRP4在NMJ形成方面发挥关键作用，但目前关于LRP4在AChR-MG患者肌肉中表达情况未见报道。本研究通过建立实验性MG模型大鼠，采用蛋白免疫印迹法测定各组腓肠肌LRP4蛋白含量，进而探讨LRP4与AChR之间的关系及在NMJ处的作用。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 动物及分组 雄性Lewis大鼠30只(SPF级，河南省实验动物中心)，体质量150～200 g，平均(180.0±18.2)g。随机数字法将30只大鼠随机分为3组，每组10只大鼠，分别记为EAMG组、对照组、空白组。

1.1.2 试剂及仪器 结核菌素(北京百奥莱博科技有限公司)，弗氏不完全佐剂(北京百奥莱博科技有限公司)，反转录试剂盒(TaKaRa公司)，兔抗鼠LRP4抗体(美国sigma公司)，兔抗鼠β-actin抗体(美国sigma公司)，HRP标记的羊抗兔抗体(美国sigma公司)，Keypoit Portable诱发电位仪(迈康诱发电位仪)。

1.2 方法

1.2.1 免疫抗原的制备 用Trizol一步法提取小鼠LRP4 RNA，按反转录试剂盒说明书将RNA反转成cDNA，将cDNA转入Pet30质粒，再将Pet30-LRP4质粒转入BL21细菌中表达，收集表达的目标蛋白，超声波破碎10 min，4℃离心10 min，取上清液纯化蛋白，目标蛋白冻干保存，经SDS-PAGE凝胶电泳检测LRP4蛋白条带。

1.2.2 免疫动物 将LRP4冻干粉溶于PBS缓冲液中配成浓度为1 mg/ml的抗原溶液。将结核菌素以1 mg/100 μl的浓度与弗氏不完全佐剂混合成弗氏完全佐剂(CFA)，经超声乳化制成抗原乳剂。EAMG组背部皮下注射抗原乳剂200 μl，对照组在相同部位注射200 μl弗氏完全佐剂，空白组在相同部位注射200 μl生理盐水，各组均免疫8周。免疫后按Lennon评分法对各组进行评分：0分，没有肯定的肌无力表现；1分，休息时肌力正常，但连续抓挠20次后，下颌无力抬起；2分，休息时呈无力状态；3分，严重肌无力，无撕咬动作，呼吸困难，瘫痪。

1.2.3 低频重复电刺激(RNS)检测 免疫8周后，用10%的水合氯醛麻醉大鼠，固定四肢及头部，分离坐骨神经，使用Keypoint Portable 诱发电位仪检测RNS，检测时使用5 Hz的低频刺激，计算第4个出现的肌电波波幅与第1个肌电波波幅的比值，以减低15%以上为阳性。

1.2.4 腓肠肌LRP4蛋白含量检测 每组大鼠取腓肠肌30 mg进行检测，将腓肠肌置于液氮中快速研磨得到匀浆，加入裂解液，6000 r/min离心10 min后取上清。BCA法测细胞蛋白浓度，每孔加30 μl样品，β-actin作为内参，稀释比例1∶1000兔抗鼠LRP4抗体及1∶3000兔抗鼠β-actin抗体4℃孵育过夜，37℃复温30 min，稀释比例1∶5000 HRP标记的羊抗兔抗体37℃孵育1 h。曝光胶片，应用Quantity One图像处理软件分别测定LRP4蛋白和β-actin蛋白条带平均值，各组蛋白相对含量为二者平均值比值。

2 结 果

2.1 制备LRP4蛋白抗原 见图1。BL21细菌表达含量为172 KD的LRP4蛋白。

图1 BL21细菌表达的LRP4蛋白SDS-PAGE凝胶电泳

2.2 各组大鼠RNS衰减率的比较 见表1。EAMG组所有大鼠在8周后出现肌无力症状，对照组、空白组大鼠无肌无力症状。EAMG组大鼠RNS衰减率明显高于对照组和空白组(均P<0.05 )。

2.3 各组大鼠腓肠肌LRP4蛋白含量的比较 见表1。EAMG组大鼠腓肠肌LRP4蛋白的相对含量明显低于对照组和空白组(均P<0.05 )。

表1 各组大鼠RNS衰减率、LRP4蛋白含量的比较(x±s,n=10)组别RNS衰减率LRP4蛋白相对含量空白组1.58±0.350.67±0.05对照组1.72±0.560.71±0.06EAMG组18.33±2.37*△0.35±0.02*△ 注:与空白组比较*P<0.05;与对照组比较△P<0.05

3 讨 论

MG是一种自身免疫性疾病，临床表现包括肌肉无力和易疲劳性，肌无力症状通常在活动后加重，休息后缓解[3]。大约85%的MG患者血清中可以发现AChR抗体[4]，血清中的AChR抗体破坏突触后膜AChR，使其在突触后膜数量减少，而参与AChR信号通路的其他分子在MG发病过程中含量变化尚无报道。本实验通过建立实验性EAMG大鼠模型，研究AChR信号通路上LRP4分子在MG发病过程中的含量变化，进一步了解LRP4在神经肌肉接头处的作用。

本实验中，EAMG组所有大鼠均出现肌无力症状，对照组、空白组大鼠均未表现出肌无力症状，通过RNS更进一步证实EAMG组大鼠腓肠肌重复电刺激均出现衰减情况；对照组、空白组腓肠肌重复电刺激无衰减情况，表明AChR抗原可诱导体内产生AChR自身抗体，产生EAMG大鼠，而对照组、空白组不能诱导产生EAMG，说明单独使用弗氏完全佐剂或生理盐水，并不能诱导大鼠出现肌无力症状。LRP4是神经肌肉接头处的跨膜蛋白，主要作用是介导受体的内吞及信号传导[5-6]。有研究[7]报道，LRP4蛋白对NMJ的稳定有一定作用。本实验中EAMG组大鼠腓肠肌中LRP4含量较对照组、空白组LRP4含量明显减少，差异有统计学意义；对照组、空白组中LRP4蛋白含量差异无统计学意义。表明当突触后膜AChR被破坏时，突触后膜处的LRP4蛋白含量也会减少。说明LRP4蛋白是NMJ信号通路完整的重要分子，其对AChR的生理功能有重要作用;LRP4蛋白能维护NMJ的结构稳定，进一步促进AChR在突触后膜的聚集。在AChR抗体阴性的MG患者中，有少部分患者血清中可检测出LRP4抗体[8]，被称为LRP4-MG，此型MG的临床治疗类型与经典的MG并不相同。通过本实验进一步了解LRP4蛋白的功能，对以后研究LRP4-MG发病原因及临床治疗提供一定研究基础。

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Express characteristics of low density lipoprotein receptor related protein 4 in gastrocnemius muscle in experimental autoimmune myasthenia gravis rats model

YANBin,ZHUMing-zhen,LIWei-jun,etal.

DepartmentofNeurology,thePeopleHospitalofPuyangCity,Puyang457000,China

Objective To observe the express characteristics of low density lipoprotein receptor related protein 4 (LRP4) in gastrocnemius muscle in experimental autoimmune myasthenia gravis (EAMG) rats model. Methods Thirty rats were randomly divided into EAMG group, control group and blank group. Acetylcholine receptors (AChR) gene in mice was the template synthesis of AChR antigen, and Lewis rats were the immuned animal. The rats of EAMG group were immunized with the AChR antigen and complete Freund’s adjuvant. Control group were immunized with the complete Freund’s adjuvant. The rats of blank group were immunized with the physiological saline. The decrement percentage of repetitive never stimulation (RNS) of each group muscle after 8 weeks was detected. The content of LRP4 in gastrocnemius muscle cells was detected by Western Blot.Results The rats of EAMG group were found symptoms of muscle weakness after 8 weeks, but the control group and blank group were not found symptoms of muscle weakness in rats. The attenuation rate of RNS in EAMG group was significantly higher than those in the control group and blank group (allP<0.05). The expression of LRP4 in EAMG group was significantly lower than those in the control group and blank group (allP<0.05). Conclusions In EAMG rats, when the AChR destroyed by autoantibodies, the whole article signaling pathways is damaged, and the expression of LRP4 is decreased. LRP4 is a neuromuscular joint complete important molecules.

low density lipoprotein receptor related protein 4; myasthenia gravis; active immunization; acetylcholine receptors

457000河南省濮阳市人民医院神经内科(闫斌，朱明振，李卫君)；河北医科大学第二附属医院神经内科(霍颖浩)

R746.1

A

1004-1648(2017)02-0131-03

2016-08-30

2016-09-09)