云南四种普洱茶中微生物的分离纯化

晏爱芬+余丽+韩云永

（保山学院资源环境学院，云南保山，678000）

摘 要：采用稀释涂布法从4种普洱熟茶中分离到2株真菌、13株细菌。2株真菌中，1株为黑曲霉（Aspergillus niger），1株为青霉（Penicillium）；13株细菌中，有3株为革兰氏阴性菌，10株为革兰氏阳性菌。

关键词：普洱茶 微生物 分离纯化

云南普洱茶因其发酵方式不同，分为熟茶和生茶。熟茶是将鲜叶摊放、杀青、揉捻、日光干燥后，进行微生物发酵、渥堆等人工处理，使茶性温和、醇香浓厚而制成的茶叶，普洱茶的香味放置时间越长越浓郁。发酵普洱茶的微生物有真菌和细菌，其中真菌主要有曲霉属、根霉属、青霉属等，通过研究确定曲霉属是普洱茶发酵中的优势菌种，有助于提高普洱茶的熟化速度。本文主要是从市场购买4种不同的普洱熟茶，从中分离真菌和细菌，初步研究普洱茶中微生物的多样性。

一、材料与方法

（一）实验材料

（1）材料：普洱熟茶（昆明红庙杨马村）、普洱熟茶（云南普洱茶厂）、普洱砖茶（熟茶、思茅景谷李记谷庄）、陈香普洱（熟）茶（云南隆达盛茶业有限公司）。

（2）培养基

马铃薯培养基：200g马铃薯浸汁，20g葡萄糖，15～20g琼脂，H2O 1000mL，pH自然。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.4～7.6。

（二）实验方法

1.微生物的分离与纯化

（1）制备普洱茶的稀释液：称取1.0g的各种普洱茶迅速放入99mL无菌水中，放置于振荡培养箱中振荡30min，使茶充分溶解于蒸馏水中，制成10-2倍茶悬液，静置30min。

（2）接种：将稀释液取0.1mL接种于表1所示的选择性平板培养基表面中央，用无菌涂布器将茶悬液在平板上朝相同的方向推移，使其在平板上分布均匀。

（3）菌种分离纯化

经24小时培养的细菌单菌接种于无菌培养基，重复3次得到纯化的细菌菌落。

将5-7天长出的真菌菌落进行重复培养2次，得到纯化的真菌菌落。

2.光学显微镜观察

对培养12～14h的细菌进行革兰氏染色，并观察菌体形状。

真菌菌落长出后，用接种针从平板上挑取少量菌丝体置于载玻片，光学显微镜下观察其孢子及孢子丝的形态。

二、实验结果

（一）细菌的菌落形态特征

通过3次分离纯化后，得到13株细菌，其菌落特征及光学显微镜观察后，结果见表2所示。

（二）真菌的菌落特征及显微观察

真菌的菌落特征

从表3中可以知道，经过4种茶类的接种、分离纯化后得到2种真菌，通过菌落形态及光学显微观察后，这两种真菌分别是青霉和黑曲霉。

三、结论

对4种普洱熟茶进行分离纯化，得到2株真菌、13株细菌。2株真菌中有一株为青霉，颜色是青褐色，菌落边缘有白色皱纹；一株是黑曲霉，菌落边缘有少量绒毛，颜色是黑褐色。

细菌经过革兰氏染色后，13株细菌中有10株是革兰氏阳性菌，3株是革兰氏阴性菌，形状都是杆状。

参考文献：

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作者简介：晏爱芬（1976-），女，保山学院资源环境学院，副教授，硕士，研究方向为生物学的研究。