黄芪—莪术不同提取物抗肿瘤作用研究

姚远+仝立国+冯玛莉+范惠霞

[摘要] 目的 研究不同方法提取的黃芪-莪术提取物的抗肿瘤作用。 方法 建立人肝癌细胞株HepG2模型，分别以95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、传统水煎四种方法为提取工艺，用CCK-8法检测不同提取物对HepG2细胞抑制生长作用，并用流式细胞法检测其体外诱导HepG2细胞凋亡的情况。用小鼠肝癌H22细胞建立移植性肝癌模型，检测上述提取物体内抗肿瘤活性，用免疫组织化学法检测H22肝癌组织中NF-κB p65的表达情况。 结果 CCK-8结果显示，与阴性组相比，黄芪-莪术95%乙醇和50%乙醇提取物组最高抑制率分别为89.13%、78.36%，差异有统计学意义（P<0.05），醇沉和水煎提取物组最高抑瘤率分别为20.38%、18.78%，差异无统计学意义（P>0.05）。流式细胞术结果显示，95%乙醇提取组和50%乙醇提取物组能明显诱导HepG2细胞凋亡，水提醇沉组和传统水煎组效果不明显。95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、传统水煎四种提取物对小鼠H22荷瘤均有一定的抑瘤效果，抑瘤率分别为47.55%、36.12%、29.96%、34.68%。与模型组相比，95%乙醇和50%乙醇提取物组能明显降低H22荷瘤组织中NF-κB p65水平的表达 （P<0.05）。 结论 黄芪-莪术95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、传统水煎四种提取物均有抑制小鼠H22荷瘤生长作用，但是只有95%乙醇和50%乙醇提取物能抑制NF-κB p65蛋白的表达，并有抑制人肝癌HepG2细胞生长及诱导其发生细胞凋亡的作用。

[关键词] 黄芪；莪术；HepG2细胞；细胞凋亡；NF-κB p65

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）07-0033-04

[Abstract] Objective To study the anti-tumor effect of the extract of Astragalus and Curcuma zedoaria Rosc by different methods. Methods Liver cancer cell line HepG2 model was established by four kinds of methods including 95% ethanol， 50% ethanol， water extraction and ethanol precipitation and the traditional decoction for the extraction process.The inhibitory effect of different extracts on the growth of HepG2 cells was detected by CCK-8 method.And the apoptosis of HepG2 cells was detected by flow cytometry.The model of transplanted hepatocellular carcinoma（HCC） was established by mouse liver cancer H22 cells.The antitumor activity in the above-mentioned extract was examined. The expression of NF-κB p65 in H22 hepatocellular carcinoma tissues was detected by immunohistochemistry. Results The CCK-8 results showed that the highest inhibitory rates were 89.13% and 78.36% in Astragalus-Curcuma 95% ethanol and 50% ethanol extraction groups respectively compared with that in the negative group， and the difference was significant （P<0.05） .The highest inhibitory rates were 20.38% and 18.78% respectively in ethanol precipitation and decoction extraction groups， and the difference was not significant（P>0.05）.The results of flow cytometry showed that 95% ethanol extraction group and 50% ethanol extraction group could obviously induce HepG2 cell apoptosis， while the roles of the water extraction and alcohol precipitation group and the traditional decoction group were not obvious.Four extracts including 95% ethanol， 50% ethanol， water extraction and ethanol precipitation and traditional decoction all had inhibitory effect on H22 tumor in mice. The tumor inhibition rates were 47.55%， 36.12%， 29.96% and 34.68% .Compared with the model group， 95% ethanol and 50% ethanol extraction groups could significantly decrease the expression level of NF-κB p65 in H22 tumor tissue（P<0.05）. Conclusion Astragalus and Curcuma zedoaria Rosc 95% ethanol， 50% ethanol， water extraction ethanol precipitation and traditional decoction could inhibit the growth of H22 tumor in mice.But only 95% ethanol and 50% ethanol extracts could inhibit the expression of NF-κB p65 protein， and have the effect of inhibiting the growth of human liver cancer HepG2 cells and inducing the apoptosis of HepG2 cells.

[Key words] Astragalus； Curcuma zedoaria Rosc； HepG2 cells； Apoptosis； NF-κB p65

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球是第五个最常见的癌症，由于乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染的传播其发病率正在世界范围内不断增加，特别是肝硬化患者最易发生[1]。我国是肝细胞肝癌高发区，且死亡率均高于世界其他国家的平均水平，每年全球新发的肝癌病例中，我国就占到一半以上[2]。目前肝癌的治疗手段仍以化疗和早期手术切除为主，但能手术切除者仅占10%～15%[3]。因此肝癌的内科治疗对于中晚期患者来说显得非常重要。中药可作用于肿瘤发生和发展的多环节、多靶点，防止复发转移，副作用轻，价格低廉等优点而倍受关注。所以近年来中医药治疗肿瘤的研究的得到广泛关注，在抗肿瘤方面取得了可喜的成就。细胞凋亡普遍存在于生物界。在肿瘤的发生过程中，NF-κB的过度表达，会减少细胞凋亡发生，抑制其在肿瘤细胞中的过表达，在肿瘤的治疗中意义重大[4]。本文主要阐述黄芪-莪术不同提取物抑制人HepG2细胞生长及诱导其凋亡的作用和对小鼠H22荷瘤组织中NF-κB p65蛋白调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验药物

氟尿嘧啶注射液（上海旭东海普药业有限公司，批号：FA150205）；注射用环磷酰胺 （CTX，山西普德药业股份有限公司，批号：04141102）；黄芪 （产自甘肃，生产批号：150502），莪术（产自广西，批号：150403），均购买于毫州成源中药饮片有限公司。

1.2 试剂

CCK-8 （日本同仁，批号：FJ692）；细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物，批号：20150528）；NF-κB p65（北京博奥森生物，批号：AE063028）。

1.3 动物与瘤株

昆明种小鼠[（购自北京海淀兴旺实验动物养殖场，雌雄各半，许可证号：SCXK（京）2014-0013）]；HepG2 细胞由山西医科大学细胞生物教研室惠赠；H22细胞由山西省肿瘤医院惠赠。

1.4 仪器

BioTeK酶标仪（美国BioTeK）；Cytomics流式细胞仪（美国BECKMAN，FC 500型）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂，RE-6000A型）；离心沉淀机（上海医用分析仪器厂，LXJ-Ⅱ型）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂，101-2-S型）。

1.5 方法

1.5.1 药物提取 称取黄芪-莪术（1∶1）各200 g，粉碎成粗粉。（1）采用95%乙醇对黄芪-莪术中的挥发油以及极性较小的脂溶性成分进行提取。将粗粉加6倍量95% 乙醇，回流提取3次，每次1 h，合并提取液，浓缩干燥，即得95% 乙醇提取物。（2）采用50%乙醇对黄芪-莪术中的三萜类、皂苷类以及黄酮类等中等极性成分进行提取。方法同（1）。（3）采用水提醇沉法对黄芪-莪术中的粗总多糖进行提取。将两药材加8倍量水，提取3次，合并提取液，浓缩至一定体积后加三倍体积80%乙醇沉，放置过夜，离心，收集沉淀物，干燥，即得水提醇沉提取物。（4）采用水煎煮法对黄芪-莪术混合进行提取。将两药材加8倍量水，提取3次，每次1.0 h，合并提取液，浓缩干燥，即得水煎提取物。

1.5.2 黄芪-莪术不同提取物对HepG2细胞增殖和凋亡的影响 （1）细胞增殖抑制率：收集对数期细胞，离心，去上清，加入37℃預热培养基混匀，用细胞计数板在显微镜下细胞计数，细胞接种浓度为：1.5×105个/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，放入37℃，5% CO2培养箱中孵育24 h，各组给药终浓度分别为：95%乙醇提取物组（800、400、200、100、50 μg/mL）；50%乙醇提取物、水提醇沉物组和传统水煎物组（2000、1000、500、250、125 μg/mL），阳性对照组为顺铂 2 μg/mL，每组设3个复孔。在加药后24 h，通过CCK-8法检测每个组的OD450值，分别计算细胞抑制率，每组结果用三个复孔平均值表示。实验重复3次。细胞增殖抑制率=（阴性组OD450-实验组OD450）/（阴性组OD450-空白组OD450）×100%。（2）细胞凋亡率：根据CCK-8的结果选取黄芪-莪术95%乙醇提取物组 （400 μg/mL）；50%乙醇提取物、水提醇沉物组和传统水煎物组（2000 μg/mL）进行细胞凋亡检测。取对数期细胞，调整细胞浓度为2×105/mL，接种于6孔板，给药24 h后，1000转/min离心5 min，收集细胞，用1×PBS洗两遍，根据试剂及流式细胞仪器说明检测各组HepG2细胞凋亡情况。

1.5.3 黄芪-莪术不同提取物对小鼠H22荷瘤生长抑制作用 在无菌条件下，将H22小鼠乳白色腹水，按1∶10加入生理盐水，冲打混匀。医用酒精消毒小鼠右上腋窝部位，皮下接种0.2 mL细胞悬液。分为模型组、阳性组、95% 醇提组、50%醇提组、水提醇沉组、传统水煎组共6组，每组10只，雌雄各半。接种24 h后给药，灌胃给药，模型组每天灌等剂量的生理盐水，阳性组给予环磷酰胺（30 mg/kg），隔天腹腔注射。连续灌胃11 d后，称重，在无菌条件下剥离瘤块并称重。肿瘤抑制率=（模型组平均瘤重-实验组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。

1.5.4 免疫组化法检测H22小鼠荷瘤组织中NF-κB p65分子表达情况 将H22荷瘤组织放入4% 的多聚甲醛固定，常规脱水后用石蜡包埋，厚度4 μL连续切片，按照试剂盒的说明完成免疫组织化学染色。用Image Pro-Plus 6.0软件400倍拍摄照片，选择阳性目标染色区域，测量其累积分光密度（IOD Sum）和面积累加值（area Sum），结果用平均积分光密度（mean density）=（IOD Sum）/（area Sum）表示。

1.6 统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05代表具有统计学差异。

2 结果

2.1 黄芪-莪术四种不同的提取物对HepG2细胞增殖的抑制作用

用CCK-8法检测黄芪-莪术四种不同提取物对HepG2细胞增殖的影响，95%乙醇、50%乙醇、醇沉和水煎提取物最高抑制率分别为89.13%、78.36%、20.38%、18.78%，见表1。

2.2 黄芪-莪术不同提取物对HepG2细胞凋亡的影响

经黄芪-莪术不同提取物处理24 h后的HepG2肝癌细胞，用流式细胞仪检测，95%醇提物、50%醇提物、醇沉物和水煎物组早期凋亡率分别为49.6%、46.2%、10.1%、12.3%。与阴性对照组比，95%醇提物和50%醇提物组能明显诱导HepG2细胞凋亡，见封三图3。

2.3 黄芪-莪术不同提取物体内对H22实体瘤的抑制作用

统计结果显示，黄芪-莪术四个提取物组的平均瘤重低于模型组，与模型组相比均有显著性差异，95%醇提取物组、50%乙醇提取物组、醇沉提取物组、水煎提取物组抑瘤率分别为47.55%、36.12%、29.96%、34.68%，结果见表2。

2.4 各组H22荷瘤组织中NF-κB p65蛋白表达情况

免疫组织化学结果显示，与模型组相比，95%醇提取物组和50%醇提取物组中NF-κB p65蛋白表达水平降低，差异有显著性（P<0.01），醇沉物和水煎物组有降低趋势，但是与模型组相比较差异无统计学意义。见表3、封三图4。

3 讨论

黄芪为补气类代表药物，具有补气固表，利尿脱毒、排脓、敛疮生肌等功效。现代研究表明其主要成分为多糖类、黄酮类、皂苷类以及微量元素和氨基酸等成分[5]。莪术为行气活血类代表药物，具有行气破血，消积止痛的功效，用于癥瘕痞块，瘀血闭经，食积胀痛等症。现代研究表明其主要成分是莪术油[6]。二者的有效成分对某些肿瘤细胞有直接的抑制作用，且在机体整体水平有抑瘤作用，如治疗胃癌、肝癌、妇科肿瘤等方面已发挥初步成效[7-9]。本实验用不同种属来源肝癌细胞人HepG2肝癌细胞和小鼠H22肝癌细胞为研究对象，发现黄芪-莪术95%乙醇提取物、50%乙醇提取物、水提醇沉物和水煎提取物虽然对小鼠肝癌H22荷瘤都有一定抑制作用，但是只有95%乙醇提取物和50%乙醇提取物對人肝癌HepG2细胞有明显抑制作用。

细胞凋亡（apoptosis）是机体细胞一种自发的、有条理的生理代谢过程。细胞凋亡与生物的发育、机体免疫功能稳定以及肿瘤的发生有着密切的联系。肿瘤的发生最主要的原因就是一系列可以诱导细胞凋亡启动的因子（ced基因家族、Caspase基因家族、P53基因等）受到抑制，使细胞凋亡程序不能正常启动从而不能清除癌基因及其产物。所以细胞凋亡激活细胞发生细胞凋亡的程序，特异的杀伤肿瘤细胞，是肿瘤治疗的重要手段。在本实验中发现，四个黄芪-莪术提取中，只有95%乙醇提取物和50%乙醇提取物可以明显诱导人HepG2肝癌细胞凋亡，所以黄芪-莪术95%乙醇提取物和50%乙醇提取物诱导HepG2细胞凋亡是二者抗肿瘤作用机制之一。

NF-κB（nuclear factor-κB）是一种细胞核转录因子，与肿瘤细胞的发生、凋亡、侵袭和转移等密切相关而备受关注。在哺乳动物细胞中常以NF-κB p65与NF-κB p50 结合形成二聚体。NF-κB的激活受广泛的信号调节，其中大多数信号与细胞应激有关[10，11]。静息状态下，NF-κB主要与其抑制因子（I-κBα）结合形成复合体定位于细胞质中。当被淋巴因子、细胞因子、药物等激活后，I-κBα被水解释放出NF-κB，最后转移到细胞核[12]。大多数肿瘤细胞中NF-κB信号通路都处于持续激活状态。激活的NF-κB可以抑制TNF-α、促进VEGF等的表达，从而促进肿瘤细胞生长转移[13]。研究表明[14，15]，黄芪、莪术有抑制胃癌和乳腺癌细胞中NF-κB的表达作用。本文研究发现，与模型组相比，NF-κB p65蛋白的表达量只在95%乙醇提取物和50%乙醇提取物组明显降低 （P<0.01）。提示黄芪-莪术95%乙醇提取物和50%乙醇提取物抗肿瘤作用与有降低NF-κB p65蛋白降低有关。

综上所述，黄芪-莪术95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉和水煎四种提取物均有抑制小鼠H22荷瘤生长的作用，其中只有95%乙醇和50%乙醇提取物有抑制H22荷瘤组织中NF-κB p65蛋白表达和抑制人肝癌HepG2细胞生长及诱导其发生凋亡的作用。

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（收稿日期：2016-12-09）