一个预测的木薯衰老相关基因的获得及其功能分析

时 涛，李超萍，蔡吉苗，李博勋，黄贵修

（中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海南 海口 571101）

一个预测的木薯衰老相关基因的获得及其功能分析

时 涛，李超萍，蔡吉苗，李博勋，黄贵修

（中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海南 海口 571101）

根据水稻LRR类抗病基因Xa21的保守结构域设计1对简并引物，提取木薯抗/感细菌性萎蔫病种质E1340和GR911的基因组DNA为模板，通过PCR扩增均获得大小约0.5 kb的扩增片段。两个片段克隆、测序后获得完全一致的474 nt序列，比对发现木薯种质AM560带有与该序列高度同源的核苷酸片段。提取包括同源片段上下游各约2.2 kb的大片段序列进行基因预测，发现该片段位于1个预测基因内，命名为SLR1。该预测基因ORF全长1 641 nt，编码546 aa，与已报道的衰老相关蛋白具有较高的同源性，可能在木薯衰老相关反应中发挥重要作用。

木薯；衰老相关基因；功能分析

木薯（Manihot esculenta crantz）为大戟科（Euphorbiaceae）木薯属灌木状多年生作物，起源于热带美洲地区［1］。木薯具有粗生易长的特点，目前已在全球100多个国家和地区广泛种植，是约10亿人口的主食。据世界粮农组织（FAO）统计，近年来国际木薯总产量稳步上升，接近3亿t［2］。1820年前后，木薯从东南亚传入我国广东地区，目前已在华南地区广泛种植，北京、河北、山东地区也进行了引种试验。木薯在我国最初供食用或做饲料，目前主要用作工业原料，可生产变性淀粉、乙醇等大量产品［3］。据国家木薯产业体系的统计，2014年我国木薯种植面积约39.27万hm2，鲜薯总产量893.63万t［4］。随着我国木薯加工业的发展，国内木薯产量已经不能满足产业所需，每年均需从东南亚和非洲等地区进口大量的木薯干片及淀粉，我国是世界上最大的木薯进口国［5］。

病害防控是木薯种植中的重要问题之一。世界范围内木薯病害有30多种［6］，我国有3类9种，其中细菌性萎蔫病为害最为严重，其次为褐斑病和疫霉根腐病［7-9］。选用抗病品种能够有效地减轻病害发生，是常用的防控措施之一。目前国内外有关木薯抗细菌性萎蔫病方面的研究较少，也并未获得可用的基因资源，严重影响了抗病育种工作的进行。在植物抗病反应中，相关基因调控着一系列级联反应，发挥着核心作用，大量抗病基因已得到克隆和功能鉴定［10］。研究发现，绝大多数已克隆的抗病基因编码产物均具有保守结构域，根据该类保守域设计引物进行抗病基因类似序列（Resistance gene analogs，RGAs）的分离，再从中筛选潜在的抗病基因，称为类似序列法，近年来在相关研究中得到广泛应用。本研究根据水稻抗病基因Xa21的保守区设计简并引物，从木薯中分离了一个预测的衰老相关基因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试木薯品种 木薯种质E1340和GR911，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所木薯种质资源圃提供，卢昕等［11］已证明E1340为抗细菌性萎蔫病种质，GR911为高感种质。

1.1.2 培养基和试剂 Taq酶、dNTPs、大肠杆菌JM109感受态细胞、DNA 片段胶回收试剂盒、pMD19-T 载体，购自宝生物工程（大连）有限公司。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。大肠杆菌培养采用LB培养基（参照方中达［12］的方法制备），其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 木薯基因组DNA的提取及目的序列扩增 田间采集健康木薯叶片，参照闫庆祥等［13］的方法提取基因组DNA。根据水稻抗白叶枯基因Xa21的保守结构域设计1对简并引物Pl-F （SYGTWGGAYARGWRGGAG-3′）和Pl-R （5′- AACARTCCRR YMYWTGGT-3′），参照王洁［14］的反应体系和参数进行PCR扩增。扩增产物经电泳检测后，按说明书进行产物的回收和克隆，随机挑选3个阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。

1.2.2 目的基因预测和功能分析 参照李超萍等［15］的方法进行。

2 结果与分析

2.1 木薯基因组DNA的提取及目的序列扩增

提取木薯抗病种质E1340和感病种质GR911基因组作为模板，分别用引物对Pl-F和Pl-R进行PCR扩增，均获得大小约0.5 kb的扩增产物（图1）。回收、克隆、测序后发现两个扩增产物的核苷酸序列完全一致，长度均为474 nt。

图1 引物对Pl-F和Pl-R的PCR扩增结果

2.2 目的基因的预测和功能分析

2.2.1 序列的同源性比对 采用Blastx对所获序列进行同源性比对，结果表明其与已报道的蒺藜苜蓿、柏树、豌豆、百合等植物的衰老相关蛋白的同源性在50%以上（表1）。

表1 所获序列同源性比对结果

2.2.2 目的基因预测 将所获序列和木薯种质AM560的基因组序列进行比对，序列一致性为99%的同源片段，获得包括该片段上下游各约2.2 kb的大片段序列，采用Softberry（http：//www.softberry.com）的Hevea（橡胶树）、Arabidopsis（拟南芥）2种模式和GENSCAN （http：//genes.mit.edu/GENSCAN.html）的Maize（玉米）模式进行基因预测，结果（图2）均表明该同源片段位于一个预测基因内部，该基因暂命名为SLR1。参照同属大戟科作物的Hevea模式分析结果，该基因位于负链上，有10个外显子，TSS（转录起始位点）位于第1个外显子前约0.2 kb处，ORF全长1 641 nt，编码546 aa。

2.2.3 目的基因保守结构域分析 利用SMART软件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）、NCBI 中CDD数据库和Sanger中Pfam数据库对SLR1基因结构进行预测，发现该基因蛋白产物不具有LRR类抗病基因特有的结构域（图3）。

图2 几种预测模式对目的基因SLR1的预测结果

2.2.4 目的基因蛋白产物结构分析 利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析发现该蛋白质分子量为59.16 ku，等电点为9.19，平均疏水性（GRAVY）为-0.086。各氨基酸中，丝氨酸、亮氨酸和丙氨酸的含量最高，分别为65个（9.9 %）、57个（10.84 %）和56个（7.23 %），色氨酸和谷氨酰胺含量最低，分别为7个（2.07 %）和8个（1.69 %）。TMpred程序（http：//www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html ）预测结果表明，SLR1所编码蛋白在第3～24、80～100、219～241、241～262、306～326、335～359、352～373个氨基酸残基间存在7个由内到外的跨膜螺旋区域，在第3～15、81～100、219～239、239～262、306～329、356～373、440～457个氨基酸残基间存在7个由外到内的跨膜螺旋区域（图4）。

2.2.5 目的基因蛋白产物的聚类分析 氨基酸序列比对结果表明，SLR1基因和来自蒺藜苜蓿的几个预测衰老相关蛋白具有较高的同源性，其中XP_013443002.1的同源性最高，为49%。与部分近源蛋白序列进行聚类分析，结果表明来自蒺藜苜蓿的6个预测衰老相关蛋白XP_013443002.1、XP_013442995.1、XP_013442969.1、XP_013442966.1、XP_013442997.1和XP_013442963.1为一个分枝，与SLR1同源性最高；来自大豆的预测蛋白GLYMA_13G019300（KRH17828.1）和花生的预测蛋白（XP_016164677.1）为亲缘关系较近的一个分枝，而来自百合的预测衰老相关蛋白（ABO20851.1）和来自柏树的预测衰老相关蛋白（ACA30301.1）为亲缘关系最远的一个分枝（图5）。

图3 利用SMART（A）、NCBI中CDD数据库（B）和Sanger中Pfam数据库（C)）分析SLR1基因结构结果

图4 SLR1跨膜区域预测

图5 SLR1基因氨基酸序列的聚类分析

3 结论与讨论

本研究根据水稻抗白叶枯基因Xa21的保守结构域设计引物，分别以抗、感细菌性萎蔫病的木薯种质E1340、GR911的DNA为模板，均扩增得到完全一致的474 nt序列。该序列和木薯种质AM560的基因组序列比对后获得一个预测基因SLR1，其ORF全长1 641 nt，编码546 aa。该基因蛋白产物不具有LRR类抗病基因特有的结构域，丝氨酸、亮氨酸和丙氨酸的含量最高，色氨酸和谷氨酰胺含量最低，预测有14个跨膜结构域。氨基酸序列比对和聚类分析表明，该基因和预测的衰老相关蛋白有较高的同源性。本研究发现3个木薯种质中均带有SLR1或其同源基因，表明该基因可能在衰老相关反应中发挥重要作用。

目前，采用类似序列法从植株中分离获得大量的RGAs，很多是抗病基因的一部分或者与其是紧密连锁的。例如亚麻的4个RGAs位于抗条诱病复合N基因簇［16］，是抗病基因的一部分，而核桃中的部分NBS类RGAs仅存在于抗炭疽病核桃品种中，与抗病性相关［17］。Elízabeth等［18］从木薯中分离得到两个RGAs，与其木薯抗细菌性萎蔫病QTL连锁，其中1个在受到病原侵染5 d后表达，而另外1个是组成性表达的。李超萍等［15］也从木薯中获得1个具有NBS类抗病基因保守区的预测抗病基因。有些RGAs和抗病反应不相关，本研究所获预测基因SLR1不具备抗病基因的结构特征，而是和衰老相关蛋白具有较高的同源性。

衰老是植物生长发育的最后一个阶段，是植株在细胞、组织、器官或整株水平上生长衰退的过程，受基因调控并受内外环境因素影响［19］。叶片衰老是植物衰老的主要表现形式，是由基因控制的细胞自主有序死亡的过程［20］，该阶段叶片的主要功能是将生物大分子降解形成的营养元素输送至新生器官，供进一步生长发育或储存［21-22］。衰老和抗病反应之间是密切相关的，例如衰老相关蛋白在菊花受白锈病［23］、玉米受立枯丝核菌［24］、小麦受条锈病［25］、苎麻受根腐线虫［26］侵染后，表达量均出现了差异变化。SLR1基因是否通过参与衰老相关反应而调控木薯和细菌性萎蔫病的互作机理有待进一步深入研究。

［1］黄洁，周建国. 木薯间套作与高效利用技术［M］. 海口：海南出版社，2015.

［2］Food and agriculture organization of the united Nations. Food outlook，biannual report on global food markets［Z］. 2014.

［3］陈丽珍，叶剑秋. 我国木薯加工业的发展现状与展望［J］. 园艺与种苗，2011（3）：87-90.

［4］国家木薯产业技术体系. 木薯产业技术发展报告［Z］. 2014.

［5］盘欢. 亚洲11 国木薯生产概况［J］. 广西热带农业，2009（5）：29-31.

［6］李开绵，黄贵修. 木薯主要病虫害［M］. 北京：中国农业科学技术出版社，2008.

［7］李超萍，时涛，刘先宝，等. 国内木薯病害普查及细菌性萎蔫病安全性评估［J］. 热带作物学报，2011，32（1）：116-121.

［8］卢昕，李超萍，裴月令，等. 木薯疫霉根腐病病原初步鉴定及其生物学特性测定［J］. 热带农业科学，2014，34（8）：59-62，85.

［9］陈奕鹏，时涛，蔡吉苗，等. 木薯新发藻斑病在中国的发生调查及病原鉴定［J］. 热带作物学报，2016，37（9）：1787-1792.

［10］董继新，董海涛，李德葆. 植物抗病基因研究进展［J］. 植物病理学报，2001，31（1）：1-9.

［11］卢昕，李超萍，时涛，等. 国内603份木薯种质对细菌性枯萎病抗性评价［J］. 热带农业科学，2013，33（4）：67-70，90.

［12］方中达. 植病研究方法［M］. 第3版. 北京：中国农业出版社，1998.

［13］闫庆祥，黄东益，李开绵，等. 利用改良CTAB法提取木薯基因组DNA［J］. 中国农学通报，2010，26（4）：30-32.

［14］王洁. 水稻白叶枯病抗性相关基因及抗病基因类似序列的克隆［D］. 北京：中国农业大学，2005.

［15］李超萍，樊春俊，时涛，等. 木薯一个假定的NBS类抗病基因的获得及其功能分析［J］. 热带农业科学，2013，33（12）：35-40.

［16］Dodds P N，Lawrence C X J，Ellis J C X. Contrasting modes of evolution acting on the complex N locus for rust resistance in flax［J］. Plant J. ，2001，27 （5）：439-453.

［17］安海山，杨克强. 核桃NBS类抗病基因类似物的序列特征及其与炭疽病的抗性［J］. 中国农业科学，2014，47（2）：344-356.

［18］E lí zabeth C N，Camilo L C. Expression of two resistance gene candidates against cassava bacterial blight in cassava［J］. Acta biol. Colomb.，2008，13（2）：175-188.

［19］Norbert Brugiè re，Frédéric Dubois，Céline Masclaux，et al. Immunolocalization of glutamine synthetase in senescing tobacco（Nicotiana tabacum L.）leaves suggests that ammonia assimilation is progressively shifted to the mesophyll cytosol［J］. Planta，2000，211（4）：519-527.

［20］杨征，蔡陈崚，宋运淳．植物细胞凋亡研究进展［J］．生物化学与生物物理进展，1999，26 （5）：439-443.

［21］Izumi M，Hidema J，Makino A，et al. Autophagy contributes to nighttime energy availability for growth in Arabidopsis［J］. Plant Physiol，2013，161（4）：1682-1693.

［22］Tegeder M. Transporters involved in source to sink partitioning of amino acids and ureides：opportunities for crop improvement［J］. J Exp Bot，2014，65（7）：1865-1878.

［23］王顺利. 菊花白锈病综合防治及菊花抗病相关基因研究［D］. 北京：北京林业大学，2008.

［24］马永毅. 立枯丝核菌AG1-IA诱导玉米基因差异表达分析及防卫酶活性检测［D］. 雅安：四川农业大学，2007.

［25］万翠萍. 小麦应答条锈病菌冬孢子产生的蛋白质组学分析［D］. 杨凌：西北农林科技大学，2016.

［26］刘慧玲. 苎麻根腐线虫诱导的SSH文库构建及EST分析［D］. 北京：中国农业科学院，2013.

（责任编辑 崔建勋）

Obtaining and function analysis of predicted senescence-associated gene from cassava

SHI Tao，LI Chao-ping，CAI Ji-miao，LI Bo-xun，HUANG Gui-xiu
（Environment and Plant Protection Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops，Ministry of Agriculture/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests，Haikou 571101，China）

One pair of degenerated primers was designed based on the conserved domain of resistance gene Xa21，which had LRR-liked domain and came from rice. The genome DNA of cassava germplasm E1340 and GR911 was extracted and used as template，which was resistant and susceptible to cassava bacterial blight separately. Two products of about 0.5 kb were obtained by PCR reaction. These two products were purified，cloned and sequenced，and then the same sequences of 474 nt were got. This sequence was highly matched with the homology segment anchored on the genome of cassava germplasm AM560. The long segment including each about 2.2 kb sequences from upstream and downstream of the homology segment was obtained，then one gene was predicted and named SLR1. Sequence analysis results of SLR1 showed that the ORF included 1 641 nucleotides encoding 546 amino acids. This predicted protein was higher consistent with senescence-associated protein reported，may play an important role in senescence mechanism of cassava.

cassava；senescence-associated gene；function analysis

Q781

A

1004-874X（2017）02-0006-06

2016-10-21

农业部现代农业人才支撑计划项目（0316001）；国家木薯产业技术体系建设项目（CARS-12-hnhgx）；海南省自然科学基金（20153046）

时涛（1977-），男，博士，副研究员，E-mail：shitaofly2008@163.com

黄贵修（1968-），男，博士，研究员，E-mail：hgxiu@vip.163.com

时涛，李超萍，蔡吉苗，等.一个预测的木薯衰老相关基因的获得及其功能分析［J］.广东农业科学，2017，44（2）：6-11.