新疆和田地区维吾尔族与汉族慢性乙型肝炎患者病毒耐药性比较研究*

张 剑，买买提江·吾布力艾山，李俊红

·病毒性肝炎·

新疆和田地区维吾尔族与汉族慢性乙型肝炎患者病毒耐药性比较研究*

张 剑，买买提江·吾布力艾山，李俊红

目的 探讨新疆和田地区维吾尔族和汉族慢性乙型肝炎（CHB）患者耐药性差异。方法随机选取2015年3月～2016年1月收治的接受拉米夫定（LAM）和/或阿德福伟（ADV）治疗的CHB患者1288例，其中维吾尔族1218例，汉族70例。采用DNA微阵列芯片技术检测血清HBV rt L180M、rtM204I/V、rtA181T/V和rtN236T四个耐药突变位点。结果汉族CHB患者HBV基因型耐药比例为25.7%，显著高于维吾尔族患者的18.3%（P=0.014）；维吾尔族CHB患者男女比例为1019/199，汉族为57/13，两组性别比无显著性差异（P=0.087），但在耐药基因阳性者中，维吾尔族男性比例显著高于汉族（P=0.039）；在基因型耐药患者中，维吾尔族CHB患者血清HBV DNA水平为（5.3±0.9）lg copies/ml，显著低于汉族患者的（6.1±0.7）lg copies/ml，差异有统计学意义（P=0.012）；维吾尔族基因耐药患者血清ALT水平为（157.6±25.9）U/L、AST为（67.1±13.2）U/L、TBIL为（41.8±11.6）μmol/L，均显著低于汉族 [分别为（203.7±45.1）U/L、（85.9±22.7）u/L、（57.4±13.5）μmol/L，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）]；维吾尔族患者和汉族患者年龄分别为（37.9±10.8）岁和（38.8±12.1）岁，无明显差异（P＞0.05）；维吾尔族和汉族患者血清HBeAg阳性率分别为14.3%和18.6%，无明显差异（P=0.061）；在241例维吾尔族和汉族基因型耐药患者中，均检测出LAM和DAV的4个耐药变异位点的6种突变，分别为rtL180M、rtM204I、rtM204V、rtA180T、rtA180V和rtN236T；维吾尔族和汉族患者rtA1181T/V点位阳性率分别为18.4%和16.7%（P＞0.05），而维吾尔族患者rtA1181T/V点位阳性率显著高于汉族患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；维吾尔族和汉族患者rtL180M、rtM204I/V、rtN236T点位阳性率分别为38.6%和38.9%、27.4%和27.8%、15.7%和16.7%，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论汉族患者存在HBV基因耐药比例更高，维吾尔族男性变异比例显著高于汉族，汉族患者出现变异时血清HBV DNA、ALT、AST、TBIL水平更高，两组患者在rtA181T/V位点存在显著性差异，其他位点未见明显差异。

慢性乙型肝炎；维吾尔族；汉族；核苷（酸）类似物；耐药

多年来，核苷和核苷酸类药物（NAs）已成功用于慢性乙型肝炎（CHB）的治疗[1]。目前，常用的有拉米夫定（LAM）、阿德福韦酯（ADV）、替比夫定（LDT）和恩替卡韦（ETV）。在新疆地区，LAM和ADV的应用仍较为广泛。长期应用核苷和核苷酸类药物有较好的疗效[2]，但长期应用也出现了耐药性问题[3-5]。LMV和ADV主要的耐药变异位点有rt L180M、rtM204I/V、rtA181T/V和rtN236T等[6-9]。随着HBV耐药毒株的增多，以及先进的检测方法和技术的成熟和应用，发现了rtM204I/V位点以外的与拉米夫定耐药性发生有关的变异位点，并受到了越来越多的重视,如rtV173L、rtL180M、rtA181T、rtV207M、rtQ215S等位点的突变也可引起 HBV对拉米夫定产生耐药性。目前已证实，rtA181V/T和rtN236T的单独突变或联合突变是导致阿德福韦耐药的主要变异，同时还可伴有诸 如 rtL80V/I、rtV84M、rtV214A、rtQ215S、rtP237H等变异，这些位点的突变与乙型肝炎病毒对阿德福韦耐药的关系还不明确，可能只是一种代偿形式的突变。本研究主要对新疆和田地区维吾尔族和汉族CHB患者在病毒耐药性和耐药基因型方面的差异进行对比分析，以为有效的抗病毒治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2013年3月～2016年1月新疆和田地区传染病医院肝病科收治的CHB患者1288例，其中维吾尔族1218例（男1019例，女199例，平均年龄39.2±12.5岁），汉族70例（男57例，女13例，平均年龄36.5±10.4岁）。诊断符合慢性乙型肝炎防治指南的诊断标准。纳入标准：CHB患者在接受LAM或ADV治疗超过6个月出现病毒学突破[10，11]或生物化学突破[12]，临床考虑患者存在HBV耐药可能。排除标准：半年内使用过干扰素及其他免疫调节制剂、同时或合并感染有其他肝炎病毒、妊娠或合并其他系统疾病。所有患者均签署知情同意书。

1.2 定义 （1）病毒学突破（virological breakthrough）[10]：在未更改治疗方案的情况下，获得部分或完全病毒学应答患者血清HBV DNA水平较治疗过程中最低点上升1 lg IU/ml，并经间隔1个月以上的第 2次检测所证实；（2）生物化学突破（biochemical breakthrough）[12]：在未更改治疗方案的情况下，在治疗过程中基线升高的ALT已降至正常的患者血清 ALT再次升高；（3）基因型耐药（genotypic resistance）[13]：在抗病毒治疗过程中，检测到与HBV耐药相关的位点突变。

1.3 检测方法 采用实时荧光定量PCR法检测HBV DNA（达安基因生物有限公司）；采用HBV耐药检测试剂盒（博奥生物科技有限公司）提取血清DNA,采用DNA芯片检测4个HBV变异位点中的6种突变（博奥生物科技有限公司）。

1.4 统计学方法 应用SPSS 15.0软件行统计学分析。对符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验；对非正态分布的计量资料以M（IQR）表示，采用秩和检验。对计数资料以%表示,采用Pearson x2检验或Fisher确切概率计算，以P＜0.05被认为有统计学意义。

2 结果

2.1 维吾尔族与汉族CHB患者一般资料比较 汉族CHB患者HBV基因型耐药比例显著高于维吾尔族患者（P=0.014）；两组性别比未见显著性差异（P=0.087），但在耐药基因阳性者中，维吾尔族男性比例显著高于汉族（P=0.039）；在基因型耐药患者中，维吾尔族血清HBV DNA水平显著低于汉族，差异有统计学意义（P=0.012）；发现HBV DNA基因耐药时，维吾尔族患者血清ALT、AST、TBIL水平显著低于汉族，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜ 0.01）；维吾尔族与汉族患者年龄无显著性差异（P＞0.05）；维吾尔族与汉族患者血清HBeAg阳性率比较，无明显差异（P=0.061，表1）。

2.2 HBV耐药基因突变情况 在241例基因型耐药患者中，分别检测出LAM和ADV的4个耐药变异位点的 6种突变，分别为 rtL180M、rtM204I、rtM204V、rtA180T、rtA180V和rtN236T。

表1 维吾尔族与汉族CHB患者一般资料（n±s）比较

表1 维吾尔族与汉族CHB患者一般资料（n±s）比较

维吾尔族（n=1218） 汉族（n=70） t/x2 P性别（男/女） 1019/199 57/13 4.579 0.087年龄（岁） 37.9±10.8 38.8±12.1 2.588 0.851基因型耐药 223（18.3） 18（25.7） 11.923 0.014血清HBV DNA（lgcopie/ml） 5.3±0.9 6.1±0.7 9.983 0.012耐药HBV基因型（B/C/D） 1/4/225 7/12/2 - -ALT（U/L） 157.6±25.9 203.7.6±45.1 12.852 0.001 AST（U/L) 67.1±13.2 85.9±22.7 9.516 0.029 TBIL（μmol/L) 41.8±11.6 57.4±13.5 11.577 0.010 HBeAg阳性 174（14.3） 13（18.6) 5.810 0.061

2.3 维吾尔族与汉族CHB患者常见耐药基因突变比较 维吾尔族和汉族患者都检测出4个耐药变异位点的6种变异。维吾尔族患者rtA1181T/V点位阳性率显著高于汉族患者，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；维吾尔族和汉族患者rtL180M、rtM204I/V、rtN 236T点位阳性率差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。2.4维吾尔族与汉族CHB患者HBV耐药变异模式比较 见表3。

表2 维族与汉族CHB患者常见HBV耐药变异位点阳性率（%）比较

表3 维吾尔族与汉族CHB患者HBV耐药变异模式（%）比较

3 讨论

随着拉米夫定和阿德福韦作为临床上治疗乙型肝炎病毒感染的核苷（酸）类似物，HBV对这两种药物耐药的报道也越来越多[13-16]。如果乙型肝炎新发病例就存在对这两种常规药物耐药，即天然耐药，那么临床再使用这两种药物不仅不会对患者体内的HBV进行有效的抑制，延缓肝功能损伤，反而还会延误患者的病情，提早进入肝硬化或肝癌期。因此，对还没有使用拉米夫定和阿德福韦治疗之前就对两种药物的常见耐药变异进行检测是有必要的[17，18]。对于乙型肝炎耐药基因变异的实验室检测，目前还没有金标准。临床上常用的大约有以下几种方法：即PCR产物直接测序、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RF LP）、反向杂交法、实时PCR（real-time PCR）、基因芯片（gene chip）、限制性片段质谱多态性技术（RFMP）等。基因芯片亦称DNA芯片或 DNA微阵列芯片，具有快速、高效、敏感、平行化和自动化等诸多优点，可检测已知变异位点。随着基因芯片高通量测序技术的发展，它还可能用于检测未知变异位点。目前，国内用于核苷（酸）类似物耐药临床检测的基因芯片，在经过长期的研发和大量的临床试验研究后，已用于临床诊断[18，20]。

我国HBV基因型以B、C、D型为主，存在南北和民族差异。南方以B型为主，北方以C型多见。我国东北的黑龙江省就以C型为主要的基因型。汉族人群中以B、C型为主，D型少见。在少数民族，可见一定比例的A、D基因型。新疆主要以汉族和维吾尔族为主，由于汉族和维吾尔族在生活习惯、饮食习惯等有很大的差异，而在HBV感染率及基因型等方面也存在很大的差异。库热西江.托乎提等对和田地区维吾尔族、汉族人群HBsAg携带率的流行病学调查分析表明，和田地区汉族与维吾尔族人群HBsAg携带率存在差异，与内陆地区相比，维吾尔族人群HBsAg携带率与我国低感染区相同，而汉族人群感染率与内陆地区中度流行区一致。乙型肝炎病毒可分为A～H共8个基因型。乙型肝炎病毒基因型分布呈地域性差异且与肝脏病变程度以及药物治疗效果存在一定的相关性。已有研究报道，新疆维吾尔族乙型肝炎病毒以D基因型占优势。

国内相关研究报道，汉族人中发生乙型肝炎病毒耐药性变异的毒株以B、C型多见，而D型耐药变异发生率较低。本研究显示维吾尔族与汉族HBV基因型耐药比例为18.31% 对25.71%（P=0.014），汉族患者存在HBV基因耐药比例更高。入选时，两组患者性别比例未见显著性差异（P=0.087），但在耐药基因阳性者中，维吾尔族男性比例显著高于汉族（P=0.039）。在基因型耐药患者中，维吾尔族与汉族血清HBV DNA水平也存在差异（P=0.012）。两组发生基因耐药时，血清肝功能指标也存在差异，汉族患者血清HBV DNA、ALT、AST、TBIL水平更高。维吾尔族和汉族患者都检测出4个耐药变异位点的6种变异，两组患者在rtA181T/V位点存在显著性差异，其他位点未见明显差异。

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（收稿：2016-07-05）

（本文编辑：陈从新）

Differences of drug resistance between Uygur and Han patients with chronic hepatitis B in Hetian prefecture，Xinjiang

Zhang Jian，Maimaiti Jiang.Wubuliaishan，Li Junhong.Department of Emergency，You’an Hospital，Capital Medical University，Beijing，100069，China

ObjectiveTo investigate the differences of drug resistance between Uygur and Han patients with chronic hepatitis B in Hetian prefecture，Xinjiang Uygur autonomous region. Methods 1218 Uygur and 70 Han patients with chronic hepatitis B（CHB）receiving lamivudine（LAM）and/or adefovir（ADV）between March 2015 and January 2016 were admitted to Infectious Disease Hospital，Hetian prefecture，Xinjiang Uygur autonomous region.The rt L180M，rtM204I/V，rtA181T/V and rtN236T mutation of HBV were detected by DNA microarray. Results The proportion of drug-resistant HBV infection in Han patients with CHB was 25.7%，much higher than 18.3%in Uygur patients（P=0.014）；the proportion of men and women in Uygur patients with CHB was 1019/ 199，while the proportion in Han patients with CHB was 57/13（P=0.087）；the ratio of Uygur men with resistance-positive HBV infection was significantly higher than in Han（P=0.039）；serum HBV DNA levels in Uygur patients with HBV mutation was [（5.3±0.9）lg copies/ml]，much lower than in Han[（6.1±0.7）lg copies/ml，P=0.012]；in Uygur patients with genotypic resistance，serum ALT level was（157.6±25.9）u/L，AST was（67.1±13.2）U/L and bilurubin was（41.8±11.6）μmol/L，much lower than in Han patients[（203.7±45.1）U/L，（85.9±22.7） U/L，（57.4±13.5） μmol/L，respectively，P＜0.05 or P＜0.01]；the average age in Uygur and Han patients were（37.9±10.8）yr and（38.8±12.1）yr，without significant difference（P>0.05）；serum HBeAg positive rates in Uygur and Han patients were 18.6%and 14.3%，without significant difference（P=0.061）；rtL180M，rtM204I，rtM204V，rtA180T，rtA180V and rtN236T mutation of LAM and/or ADV were detected positive in 241 Uygur and Han patients.The rtA1181T/V in positive rates in Uygur and Han patients were 18.4%and 16.7%，respectively，（P>0.05），while the rtA1181T/V in Uygur patients was higher than in Han patients（P<0.05）；the rtL180M，rtM204I/V，and rtN236T positive rates in Uygur and Han patientswere38.6% and 38.9%，27.4% and 27.8%，and 15.7% and 16.7%，respectively，withoutsignificant differences（P>0.05）.Conclusion Han patients with CHB have a higher proportion of drug-resistant，and Uygur male proportion is relatively higher in patients with viral mutation.Serum HBV DNA，ALT AST and bilirubin levels are higher in Han patients with CHB.There is a significant difference in rtA181T/V mutation between the two groups.

Chronic hepatitis B；Uygur；Han；Viral resistance

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.01.008

中国初级卫生保健基金会资助项目【京佑基金（2015）第310号】

100069北京市 首都医科大学附属北京佑安医院急诊科（张剑，李俊红）；新疆和田地区传染病医院肝病科（买买提江·吾布力艾山）

张剑，男，38岁，医学硕士，副主任医师。主要从事病毒性肝炎、脂肪性肝病和酒精性肝病诊治研究。E-mail：3299448125@qq.com