可可种质抗黑果病离体鉴定方法研究

桑利伟++高圣风++刘爱勤++孟倩倩++孙世伟++王政++苟亚峰

摘 要 利用可可离体叶片和离体果实鉴定可可种质对黑果病抗性的方法。结果表明：接种方法、接种物浓度、叶龄或果龄等因素影响离体叶片、果实黑果病发生程度；离体叶片接种鉴定方法最适条件是采用针刺法接种、接种物浓度3 × 107 个/mL、叶龄50～60 d；离体果实接种鉴定方法最适条件为采用滴接法、接种物浓度为3×105 个/mL、果龄2～3个月。采用离体叶片接种和离体果实接种方法均能鉴定出可可种质对黑果病抗性的差异，鉴定结果与田间成株期的抗病性表现基本一致。

关键词 可可 ；黑果病 ；离体抗病性鉴定

中图分类号 S435.71 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.03.011

In vitro Identification of Cacao Germplasm with Black Pod Resistance

SANG Liwei GAO Shengfeng LIU Aiqin

MENG Qianqian SUN Shiwei WANG Zheng GOU Yafeng

（Spice and Beverage Crops Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533）

Abstract The detached leaves and pods of cacao were used as materials to identify resistance of black pod disease in vitro from cacao germplasm resources. The results showed that the infection severity of black pod disease in the leaves and pods were influenced by the factors like inoculating methods， inoculum concentrations， and leaf and pod age. The optimum conditions for disease resistance identification through detached leaf inoculation were puncture inoculation， inoculum concentration 3×107 units/mL and leaf age 50～60 days. The optimum conditions for disease resistance identification through detached pod inoculation were dripping inoculation， inoculum concentration 3×105 units/mL and pod age 2～3 months. The difference of cacao germplasm in resistance to black pod disease were identified by both the detached leaf and pod inoculations， and the identification results were basically consistent with the field performance of the mature cacao in resistance to black pod disease.

Keywords Cacao ； black pod disease ； In vitro identification of disease resistance

可可（Theobroma cacao L.）是世界三大飲料之一，用于制作巧克力和高级饮料等，经济价值极高。据不完全统计，2015年，中国可可豆需求量约16万t，几乎全部依赖进口。海南省东南部适宜可可种植[1]，目前，中国热带农业科学院香料饮料研究所（简称“香饮所”）已在海南省万宁、琼海、保亭、陵水、三亚、东方等市县推广种植可可66.7 hm2。黑果病是为害可可的首要病害，广泛分布于世界各可可种植区，导致每年全世界可可产量减少约30%，部分为害严重地区减产达90%[2]，选育和推广抗病品种是防控该病的有效措施。香饮所可可种质圃已收集可可种质资源90份，经田间自然发病鉴定，不同可可种质间对黑果病抗性存在差异。国外有关于采用离体叶片接种[3]和离体果实接种[4]方法鉴定可可种质对黑果病抗性的报道，而国内还未见相关研究报道。研究利用可可离体叶片和离体果实鉴定可可种质对黑果病抗性的方法，明确了2种鉴定方法的最适条件，为抗病育种中的亲本选择提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

诱发黑果病的柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora R. et E. Smith）[5]，由香饮所在万宁兴隆可可种植园分离获得。

1.1.2 供试品种

选择连续3年田间自然发病鉴定、抗黑果病表现稳定的品种：ZYP2-7（抗病品种）、ZYP3-6（感病品种）、ZYP5-20（高感品种），均由香饮所可可种质圃提供。

1.2 方法

试验采用单因素随机区组设计，每个处理10片叶或10个果，用 0.5%的KMnO4溶液进行表面消毒15 min，无菌水冲洗干净，3次重复[6]。

1.2.1 离体叶片接种鉴定

（1）接种方法。选取叶龄50～60 d的叶片，采用血球计数法[7]配制的3 × 107 个/mL游动孢子悬浮液进行接种，接种方法为离体叶片滴接法和离体叶片针刺法。离体叶片滴接法：将洗好的叶片放入经灭菌且带滤纸的托盘内，滤纸用无菌水保湿；吸取孢子悬浮液0.2 mL滴接于叶片表面中心，以滴接无菌水为对照。离体叶片针刺法：叶片处理同上，用一束针捆在一起，沾取孢子悬浮液刺于叶片中心，每刺一片叶沾一次菌液，以无菌水为对照；覆膜保湿并置于26℃培养箱内培养，每日早晨在滤纸上滴加无菌水；接种7 d后，统计发病级别，计算病情指数，进行抗病性划分。

可可黑果病叶片病情分级标准：0级，叶片表面没有病斑；1级，叶片表面病斑面积占叶片总面积的1%以下；2级，叶片表面病斑面积占叶片总面积的1%～10%；3级，叶片表面病斑面积占叶片总面积的11%～20%；4级，叶片表面病斑面积占叶片总面积的21%～50%；5级，叶片表面病斑面积占叶片总面积的 50%以上。

病情指数计算公式：

病情指数=∑（各级病叶数×各级代表值）/（调查总叶片数×最高一级代表值）×100。

抗性划分标准：免疫，病情指数为0；高抗，病情指数在10以下；抗病，病情指数在11～30；感病，病情指数在31～50；高感，病情指数在 51 以上。

（2）接种物浓度的影响试验。将配制好的3个不同浓度梯度（即3 × 105 、3 × 107 和3 × 109 個/mL）的游动孢子悬浮液，采用离体叶片针刺法接种在叶龄50～60 d的叶片上，以无菌水为对照；接种7 d后统计发病情况，方法同1.2.1-（1），确定最适接种物浓度。

（3）接种叶龄的影响试验。在3个不同叶龄（即20～30、50～60和80 d以上）的叶片上，采用离体叶片针刺法接种浓度为3 × 107个/mL的游动孢子悬浮液，以无菌水为对照；接种7 d后，统计发病情况，方法同1.2.1-（1），确定最适接种叶龄。

1.2.2 离体果实接种鉴定

（1）接种方法。选取果龄2～3个月的可可果，以3×105个/mL的游动孢子悬浮液为接种物，接种方法为离体果实滴接法和离体果实针刺法，具体步骤同1.2.1-（1）。

可可黑果病果实病情分级标准：0级，果实表面没有病斑；1级，果实表面病斑面积占果实总面积的1%以下；2级，果实表面病斑面积占果实总面积的1%～10%；3级，果实表面病斑面积占果实总面积的11%～20%；4级，果实表面病斑面积占果实总面积的21%～50%；5级，果实表面病斑面积占果实总面积的50%以上。

病情指数计算公式：

病情指数=∑（各级病果数×各级代表值）/（调查总果数×最高一级代表值）×100。

抗性划分标准：免疫，病情指数为0；高抗：病情指数在10以下；抗病，病情指数在11～30；感病：病情指数在31～50；高感，病情指数在51以上。

（2）接种物浓度的影响试验。将游动孢子悬浮液配成3×103、3×105和3×107个/mL等3个不同浓度梯度，采用离体果实滴接法接种在果龄2～3个月的可可果上，以无菌水为对照；接种7 d后，统计发病情况，方法同1.2.2-（1），确定最适接种浓度。

（3）接种果龄的影响试验。果龄设1个月以内、2～3个月和4～5个月等3个处理，每个处理采用离体果实滴接法，接种浓度为3 × 105个/mL的游动孢子悬浮液，以无菌水为对照；接种7 d后，统计发病情况，方法同1.2.2-（1），确定最适接种果龄。

2 结果与分析

2.1 离体叶片接种鉴定

2.1.1 最适接种方法

由表1可知，采用离体叶片滴接法，各供试品种发病普遍较轻，病情指数虽依次增大，但差异小，无法区分抗性类别；采用离体叶片针刺法，各供试品种的病情指数差异明显，抗性表现与田间自然发病鉴定结果一致。因此，针刺法是离体叶片鉴定的最适接种方法。

2.1.2 最适接种物浓度

表2结果表明，3种接种物浓度对供试品种发病情况影响不同，接种物浓度与病情指数呈正相关，接种物浓度越大，发病程度越严重。当接种物浓度为3×105个/mL时，各供试品种发病较轻，高感品种和感病品种差异不明显，不能准确区分；当接种物浓度为3×107个/mL时，各供试品种间病情指数差异明显，能将抗病、感病和高感很好地区分，并且同田间自然发病鉴定结果一致；当接种物浓度为3×109个/mL时，各供试品种发病普遍严重，抗病品种和感病品种不能很好地区分，无法真实反映供试品种的抗性类别。因此，最适的接种物浓度为3×107个/mL。

2.1.3 最适接种叶龄

不同叶龄对各供试品种发病情况影响不同。由表3可知，当叶龄为20～30 d时，各供试品种发病程度较高，虽然可以区分供试品种的抗性类别，但是感病品种和高感品种的病情指数差异小，区分度不高；当叶龄为50～60 d时，各供试品种病情指数差异显著，可以将供试品种明确地归类为抗病、感病和高感3类，并与田间自然发病鉴定结果一致；当叶龄为80 d以上时，各供试品种发病程度较轻，抗病品种和感病品种病情指数差异不明显，无法显著区分，不能真实反映供试品种抗病情况。因此，采用离体叶片接种法的最适叶龄为50～60 d。

综上所述，采用离体叶片接种方法鉴定可可种质对黑果病抗性的最适条件是接种方法采用针刺法接种、接种物浓度为3 × 107 个/mL、叶龄50～60 d。

2.2 离体果实接种鉴定

2.2.1 最适接种方法

由表4可知，采用离体果实滴接法时，各供试品种间病情指数差异明显，抗病、感病和高感品种可以被明显区分，且与田间抗性表现一致；采用离体果实针刺法时，各供试品种病情发生严重，经田间自然发病鉴定表现稳定的抗性品种被归类为感病品种，不能准确体现供试品种的抗病特性。因此，最适接种方法为离体果实滴接法。

2.2.2 最适接种物浓度

各供试品种发病程度随接种物浓度增加而越来越严重（表5）。当接种物浓度为3×103个/mL时，供试品种发病程度较轻，病情指数差异不明显，抗病品种和感病品种不能被明确区分；当接种物浓度为3×105个/mL时，各供试品种的病情指数差异明显，抗病、感病和高感品种病情区分度高，适宜品种抗性评价，评价结果与田间自然发病鉴定结果一致；当接种物浓度为3×107个/mL时，各供试品种发病情况严重，病情指数普遍较高，不能真实反映供试品种抗病特性，与田间自然发病鉴定结果不一致。可见，最适接种物浓度为3×105个/mL。

2.2.3 最适接种果龄

表6结果表明，当果龄为1个月以内时，各供试品种发病情况严重，病情指数普遍偏高，不能客观反映供试品种抗病性，在田间表现稳定的抗病品种会出现感病品种的发病症状；当果龄为2～3个月时，各供试品种病情指数差异显著，供试品种被归类为不同的抗性类别，并且与其田间抗病性表现一致，适宜用于抗性鉴定；当果龄为4～5个月时，各供试品种发病程度较轻，病情指数偏小，感病品种和高感品种抗病性区分度不高，会出现与田间自然发病鉴定结果不一致情况。因此，最适接种果龄为2～3个月。

综上所述，采用离体果实接种法鉴定可可种质对黑果病抗性的最适条件是接种方法采用滴接法、接种物浓度为3×105个/mL、果龄为2～3个月。

3 讨论与结论

对于离体叶片接种法，采用滴接法接种，各可可品种发病程度较轻，对于田间表现为感病的品种可能被归类为抗病品种；采用针刺法接种，抗病、感病和高感品种间区分度高，鉴定结果與田间抗病性表现一致。接种物浓度会影响叶片的发病程度和保绿时间，接种量过少，叶片发病程度普遍偏轻；接种量过大，叶片发病程度偏严重，保绿时间短，都不能真实反映品种抗病性，适宜的接种物浓度为3×107个/mL。幼嫩叶片保绿时间短，老化叶片品种抗病性普遍偏弱，均不适宜抗病性鉴定，最适叶龄为50～60 d。采用离体叶片接种方法鉴定可可种质对黑果病抗性的最适条件是采用针刺法接种、接种物浓度为3×107个/mL、叶龄为50～60 d。对于离体果实接种法，采用针刺法时，各品种病情发生偏严重，适宜的接种方法是滴接法。接种物浓度对果实发病程度有明显影响，接种量过少或过大均不能真实反映品种抗病性，适宜的接种物浓度为3×105个/mL。幼果保存时间短，接种后病情偏严重；老龄果，品种发病程度偏轻，最适接种果龄为2～3个月。采用离体果实接种法鉴定可可种质对黑果病抗性的最适条件为采用滴接法接种、接种物浓度为3×105个/mL、果龄为2～3个月。

关于可可种质抗黑果病鉴定方法的研究在国内未见报道。国外学者将离体叶片接种法作为可可抗黑果病早期鉴定的方法进行了研究，结果表明，以选取未木质化的枝条上或叶龄在50～60 d的叶片为宜，一般苗圃里可可苗的叶片比田间生长植株上的叶片鉴定效果更好，接种游动孢子浓度为3×105 个/mL的病原菌，5～7 d后观察结果，该方法能快速准确地反映不同可可种质对黑果病的抗性[3，8]。 也有专家采用离体果实接种法进行了可可种质抗黑果病鉴定[4]，其鉴定结果与连续3年以上的田间观察数据具有显著的相关性，该方法有助于实现抗黑果病可可种质的早期快速筛选。可可对黑果病的抗性能够稳定地遗传给后代[9-10]。叶片接种是早期可可抗黑果病鉴定的最合适方法，按照标准化的方式，在最适条件下，该方法可解释可可种质抗黑果病遗传变异的75%～90%[11-12]。

本研究结果表明，采用离体叶片接种方法鉴定可可种质对黑果病抗性的最适接种物浓度是3×107个/mL，而采用离体果实接种方法的最适接种物浓度是3×105个/mL，同Nyassé等[3]和Iwaro等[4]研究结果不同，原因可能是病原菌致病性不同。综上所述，采用离体叶片接种法和离体果实接种法均能鉴定出不同可可种质对黑果病抗性的差异，鉴定结果与田间抗病性表现基本一致。但是不同接种方法、接种物浓度和接种叶龄对鉴定结果有影响。为提高可可种质抗黑果病鉴定的准确性，应采取离体鉴定与田间自然发病鉴定相结合的方法。

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