超声法制备婴儿配方营养油乳液工艺的优化

李 奥 彭凯迪 冯 伟 程熠娜 祝爱侠 王春维（武汉轻工大学食品科学与工程学院；动物科学与营养工程学院，武汉 430023）

超声法制备婴儿配方营养油乳液工艺的优化

李 奥 彭凯迪 冯 伟 程熠娜 祝爱侠 王春维
（武汉轻工大学食品科学与工程学院；动物科学与营养工程学院，武汉 430023）

为了降低婴儿配方营养油中不饱和脂肪酸的氧化酸败和提高其消化吸收，该研究以调和油为油相、乳清蛋白为壁材，将乳化剂溶于油相，超声法制备成纳米级乳化液，利用喷雾干燥法将纳米乳液制备成微胶囊粉末。以乳液粒径为响应值，用响应面分析法研究乳化剂添加量、超声功率和超声时间等因素对乳液粒径和喷雾干燥产品表面含油率的影响，优化制备工艺。结果表明，最佳工艺条件为：卵磷脂（PC）质量分数5.0%、超声功率660 W和超声时间20 min，乳液的平均粒径为（184.37±0.64）nm，微胶囊表面含油率为5.82%，依据此响应面模型数据可有效指导试验操作。喷雾干燥后的产品品质较好，在体外消化模拟试验中，在禁食和喂食状态下纳米乳液的游离脂肪酸释放量均高于未处理调和油。

超声技术 纳米乳液 喷雾干燥 响应面试验 体外模拟消化

母乳脂质是婴儿的主要能量来源，其中的脂肪酸组成和分布对婴儿的生长健康具有重要意义。以母乳主要的5种脂肪酸含量为标准，确定原料油脂的添加量，其中调和油比例为：大豆油∶玉米油∶OPO结构脂∶二十二碳六烯酸∶花生四烯酸=11.18%∶8.40% ∶79.88%∶0.13%∶0.41%；然而选用的调和油不饱和脂肪酸的含量较高，容易受到环境中光、氧气等因素的影响导致其氧化酸败。此外考虑到花生四烯酸和二十二碳六烯酸腥味较重，不易被婴幼儿所接受，同时由于油脂配料本身具有亲脂性，很难与亲水性物质混合，而且易发生分层，所以利用一些材料将其包裹制备成水包油型纳米乳液不仅能够遮盖调和油的鱼腥味、改善风味、提高分散性、保持良好稳定性，而且也可有效提高配方油脂的消化吸收率和生物学效价。

利用超声波制备纳米乳液的技术发展较快。超声波作用原理主要表现为空化效应，并伴随有一系列的热学、化学和机械的超声效应。空化效应产生的微气泡有很高的聚能能力，在空化气泡崩溃时会形成局部高能部位［1］，由此推进物质粒子运动速度加快，从而促使了液体的乳化。超声波法相对于高压均质机有很多潜在优势，如设备成本低、占用空间小、所需技术支持少、清洗和维修方便等，同时超声波还具有一定的自我消毒的抗菌性能［2］。由于纳米乳液在常温下一般以液态形式存在，考虑到贮存、运输等问题，同时为延长其保质期、提高性能，一般采用喷雾干燥法进行二次包埋，将液体状物料经雾化器雾化成细小液滴，迅速蒸发使其转变成微胶囊粉末，有利于存放［3］。

本研究是以符合母乳标准的调和油为对象研究微胶囊粉末的制备工艺，将Box-Behnken中心组合设计原理应用在制备工艺中，探讨乳化剂添加量、超声时间和超声功率等因素对乳液粒径的影响，利用响应面分析法优化制备工艺，并对喷雾干燥产品进行表征，深入改善奶粉脂质的消化吸收特性，为油脂在奶粉中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆油、玉米油：市售；OPO结构脂：瑞典AAK公司徐州一统食品工业有限公司；DHA藻油、ARA藻油：武汉嘉必优生物工程有限公司；乳清蛋白：新西兰恒天然有限公司；PC75卵磷脂：德国LIPOID公司；DHA标准品、ARA标准品、牛磺脱氧胆酸钠（NaTDC）、胰脂肪酶、三羟甲氨甲烷-马来酸均：Sigma公司；15种脂肪酸混标：北京世纪奥科生物技术有限公司；正己烷（色谱级）：天津科密欧公司。

1.2 仪器设备

7890／5975I气质联用仪：美国Agilent公司；毛细管色谱柱 HP-FFAP：美国 Agilent公司；离心机（TGL205）：长沙平凡仪器仪表有限公司；涡旋混合器（S25）、T18高速分散机：德国IKA公司；JY92-IIDN超声细胞破碎仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；B-191喷雾干燥仪：瑞士BUCHI公司；904pH -stat自动点位滴定仪：瑞士万通公司；S-3000N扫描式电子显微镜：日本日立公司；Zetasizer Nano-ZS90型激光粒径仪：英国Malvern公司。

1.3 试验方法

1.3.1 微胶囊粉末的制备

参考孙兰萍等［4］的方法并加以改进，以调和油为油相，乳清蛋白为壁材，添加VE作为抗氧化剂，将乳化剂卵磷脂PC75溶于油相，在一定温度下溶胀，再将两相混合，经高速搅拌一定时间，超声细胞破碎制备成纳米级乳化液（采用冰浴的方式使得乳液体系温度不超过25℃）。本试验中喷雾干燥的进口温度为160℃，出口温度75℃，泵流速为18%，转子流量计流速为600 L／h。根据乳化剂添加量、超声时间和超声功率3个单因素试验结果，采用统计分析软件中的响应面方法的Box-Behnken中心组合设计原理，以乳液粒径和喷雾干燥产品表面含油率为响应值，设计三因素三水平的响应面优化试验，分析得到最佳工艺参数。

1.3.2 响应曲面试验设计

根据乳化剂添加量、超声时间和超声功率3个单因素试验结果，采用统计分析软件中的响应面法的Box-Behnken中心组合设计原理，以乳液粒径为响应值，设计三因素三水平的响应面优化试验，分析得到最佳工艺参数，响应面设计因素水平表见表1。

表1 响应面设计因素水平表

1.3.3 乳液颗粒粒径及电位测定

取少许产品用蒸馏水溶解，按一定的比例稀释，利用马尔文激光粒度分析仪在25℃测定产品的平均粒径和粒径分布［5］。

1.3.4 喷雾干燥产品表面油含量的测定

精确称取质量为2～3 g的经喷雾干燥的油脂粉末产品，用40 mL石油醚在轻微搅拌下准确浸提1 min，立即用G3砂芯漏斗抽滤，用25 mL石油醚洗涤滤渣40 s，立刻抽滤，将滤液转移至已恒重的锥形瓶（m1）中，回收石油醚后蒸干，在65℃下真空烘干至恒重（m2），计算表面油质量分数［6-7］。

式中：m为产品质量／g；m1为锥形瓶质量／g；m2为浸提烘干产品与锥形瓶总质量／g

1.4 微胶囊粉末的表观评价、理化指标和贮存稳定性进行评价

1.4.1 微胶囊粉末感官评价

在本试验中，主要通过产品的外观、色泽、气味、冲调性等指标对包埋产品进行综合性能感官评价［8-9］。

1.4.2 微胶囊粉末复原乳状液的性能评价

称取少许喷雾干燥产品，加70℃的热水冲泡搅拌，待溶解后置于自然光下观测，并静置24 h观测其组织形态［10］。

1.4.3 微胶囊粉末微观结构

采用扫描电镜观察产品的微观结构，直接取适量固体样品，用双面胶固定在载玻片上，离子溅射仪镀上一层金膜，随后置于扫描电镜下观察颗粒微观形态。

1.4.4 微胶囊粉末表面油含量的测定

方法同1.3.4。

1.4.5 微胶囊粉末含油量的测定

称取0.2 g样品溶于10 mL蒸馏水中，加入2 mL体积分数为25%的氨水，置于65℃水浴15 min，取出轻摇，冷至室温。加入1 mL乙醇混匀，加入2.5 mL乙醚，加塞振荡1 min，加入2.5 mL石油醚，加塞振荡1 min，离心或静置，使醚层，水层分开，有机层转入到烧杯中，第2次提取加入的试剂为0.5 mL乙醇，加入1.5 mL乙醚，1.5 mL石油醚，操作同第1次， 第3次只加1.5 mL石油醚，把提取的醚层合并，减压浓缩至干［11］。

式中：m为奶油粉质量／g；m1为锥形瓶质量／g；m2为脂肪和锥形瓶的总质量／g。

1.4.6 微胶囊粉末包埋率的计算

产品包埋率的计算公式［12］：

1.4.7 微胶囊粉末脂肪酸含量检测

样品处理：加入2.5 mL正己烷和100 μL 0.5 mol／L甲醇钠溶液对油脂中的脂肪酸进行甲酯化。

色谱柱HP-FFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）进样量为1 μL，分流比为10∶1，进样口温度220℃，检测器温度250℃。质谱条件：EI离子源；电子能量70 eV；离子源温度230℃；将产品用温水溶解，提取油脂，甲酯化处理，并对其进行GC-MS分析。

1.4.8 微胶囊粉末抗氧化性贮藏试验

根据Schhal烘箱测试法进行加速储存试验每隔2 d取样测其过氧化值，观察其相当于1年的贮藏性能试验。过氧化值测定按GB／T 5009.37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》中的比色法测定。

1.4.9 微胶囊粉末的体外模拟消化试验

1.4.9.1 pH7.5消化液的制备：分别称取三羟甲氨甲烷-马来酸（Trizma mealate）50 mmol／L，氯化钠（NaCl）150 mmol／L，二水合氯化钙（CaCl2·2H2O）5 mmol／L溶于适量蒸馏水中，溶解后混匀。利用0.1 mol／L的NaOH溶液将其pH值调整到7.5，冷藏保存［13］。

1.4.9.2 NaTDC／PC的制备

禁食状态：取1.25 mmol／L PC于100 mL圆底烧瓶中，加入适量氯仿，待PC完全溶解后，旋转蒸发除去氯仿，烧瓶底部形成一层黄色薄膜。取5 mmol／L NaTDC与一定量消化液加入烧瓶中，搅拌12 h后，形成黄色透明溶液即可。

喂食状态：取5 mmol／L PC于100 mL圆底烧瓶中，加入适量氯仿，待PC完全溶解后，旋转蒸发除去氯仿，烧瓶底部形成一层黄色薄膜。取20 mmol／L NaTDC与一定量消化液加入烧瓶中，搅拌12 h后，形成黄色透明溶液即可。禁食状态和喂食状态组分浓度如表2所示。

表2 喂食和禁食条件下NaTDC／PC组分浓度

1.4.9.3 胰脂酶的提取

取1 g酶溶于5 mL上述消化液中，1 600×g离心力，4℃ 离心15 min，收集上清液，现配现用。

1.4.9.4 利用pH-star滴定仪模拟体外脂解试验

将0.6 g样品复原乳液加入36 mL NaTDC／PC中，pH调至7.5，在中速37℃条件下搅拌15 min后，加入相当于4 mL 10 000 TBU（1 TBU相当于每分钟分解三丁酸甘油酯产生l μmol脂肪酸所需的酶量）的胰脂酶提取液模拟肠道消化开始脂解，60 min后加60 mL（95%乙醇）终止反应，记录整个滴定过程中不同时刻的滴定体积。

1.4.9.5 脂质分解程度的测定

式中：VNaOH（t）为NaOH溶液在消化时间t所消耗的溶液体积；CNaOH为NaOH溶液的浓度为0.1 mol／L；MwTG为脂质分子质量；mTG为体外消化中脂质的总质量。

油脂中甘油三酯质量分数≥98%，所以油脂的平均分子质量近似为甘油三酯的平均分子质量，而甘油三酯的分子量可通过油脂的皂化值计算。

式中：SV为油脂皂化值；MwKOH为KOH的分子质量。

2 结果与分析

2.1 制备工艺响应面优化试验

采用Design Expert软件进行试验设计及数据分析，结果见表3。

表3 Box-Benhaken设计试验结果

采用Design-Expert8.0.6软件对表3的试验数据进行拟合分析，建立数学模型，并根据模型方程得出最佳试验配方。得到的关于平均粒径（Y1）和表面含油率（Y2）的多元二次回归模型方程为：

Y1=497．099 34-15．108 56×X1-0．628 29× X2-6．811 63×X3+1．835 63×10-3×X1×X2+ 0．265 83×X1×X3+2．208 25×10-3×X2×X3+ 0．861 34×X12+4．305 09×10-4×X22+0．101 85×X32

Y2=32．449 44-1．398 13×X1-0．053 879× X2-0．494 95×X3+4．875 00×10-4×X1×X2+ 0．018×X1×X3+3．075 00×10-4×X2×X3+0．070 187× X12+3．345 63×10-5×X22+4．930 0×10-3×X32

式中：Y1为平均粒径；Y2为表面含油率；X1为乳化剂用量；X2为超声功率；X3为超声时间。

对平均粒径为目标函数建立的回归模型进行方程分析，回归方程系数显著性检验结果见表4。

表4 粒径回归模型系数显著分析

由表4可知，在回归方程中模型项“P＞F”值小于0.01，差异显著，同时失拟项0.169 8＞0.05，差异不显著，表明建立的回归模型非常显著，能够较好的拟合PC质量分数、超声功率和超声时间对纳米乳液平均粒径的影响情况。该模型的回归系数为0.986 9，校正系数为0.969 8，由此可见该方程的拟合程度较好，利用该模型对乳液平均粒径优化试验进行预测分析准确度较高。在所选因素水平范围内可以看出，各因素对平均粒径的影响不同，其中B、B2极其显著，AC、A2和C2显著。由方差分析结果可以看出，3个因素对表面含油率的影响的大小为：超声功率＞超声时间＞乳化剂用量。

固定其中1个因素在零水平，可以通过模型方程作出的三维曲面图和二维等高线对其中2个试验因素进行直观分析，也可以分析各因素间的交互作用影响。

图1 各因素交互作用对乳液平均粒径影响的响应曲面及等高线图

图1为PC质量分数、超声功率和超声时间对纳米乳液平均粒径两两交互作用影响的三维曲面图和二维等高线图。如图1a和图1b所示，当超声时间为20 min，PC质量分数一定时，随着超声功率的增大，纳米乳液的平均粒径呈现先降低后上升的趋势。这是因为随着功率的增大，为超声细胞破碎提供了更多的能量用于分裂液滴，而非连续相处于不断破裂聚合的状态，当超声功率增大到一定时，整个乳液体系的温度适当提高，乳化平衡发生变化，导致更多的乳液液滴的聚结。这表明超声波功率并非越大越好，在一定范围内提高超声波功率，可以降低乳液粒径，超过此范围，乳液液滴粒径反而会增大，如Kentish等［14］在不同功率情况下制备50 mL亚麻籽油纳米乳液，随着超声功率的增大，液滴平均粒径同样呈现先减小后增大的趋势。因而选择合适的超声波功率尤为重要。当超声功率一定时，随着PC质量分数的增大，纳米乳液的平均粒径先减小后增大，但变化趋势并不明显。结合回归模型方差分析发现，乳化剂用量在达到维持乳液稳定性需求之后对乳液平均粒径的影响相对较小。如图1c和图1d所示，当PC质量分数为5%，超声时间一定时，随着超声功率的增大，纳米乳液的平均粒径呈先降低后上升的趋势。当超声功率一定时，随着超声时间的延长，纳米乳液的平均粒径先减小后增大，但超声功率对粒径的影响的变化趋势显著于超声时间对其影响。如图1e和图1f所示，当超声功率为600 W，超声时间对粒径的影响的变化趋势显著于PC质量分数对其影响。

通过响应面软件分析可以得知，纳米乳液制备最佳工艺条件为：PC质量分数5.05%，超声功率672.76 W，超声时间19.71 min，在此条件下可以得到纳米乳液的平均粒径为182.2 nm，表面含油率为5.76%。采用最优条件进行试验，同时结合实际操作情况，调整试验条件：PC质量分数5.0%，超声功率660 W，超声时间20 min，在此条件下做3次验证试验，平均粒径为（184.37±0.64）nm，表面含油率为5.82%，与理论值较为接近，由此可知，依据此响应面模型数据可有效指导试验操作。

3 微胶囊粉末性质表征

3.1 喷雾干燥产品感官评价

感官评价是在无外界因素干扰，光线充足的条件下进行，感官评价见表5。

表5 微胶囊粉末感官评价

3.2 微胶囊粉末复原乳状液的性能

产品溶解后在自然光下呈半透明的乳状液（图2），乳液细腻，黏度低，散发乳清蛋白的香味，表层无结膜，并且无颗粒挂壁，静置24 h后无分层或沉淀，稳定性较好。

图2 微胶囊粉末复原乳状液

3.3 扫描电镜图谱分析（SEM）

如图3所示，最优工艺条件下制备的纳米乳液经喷雾干燥所得包埋油脂的微观形态，可以看出包埋油脂颗粒表面比较平滑，无裂缝，呈球形，颗粒比较完整，包埋效果较好，在此条件下所得产品的粒径大约为4.16 μm，表面含油率约为5.82%。

图3 微胶囊粉末的扫描电镜图

3.4 微胶囊粉末脂肪酸含量检测结果

将产品进行前处理，使用GC-MS测定调和油脂肪酸的组成及其含量，分析色谱图（图4）确定脂肪酸的比例，并与原调和油比较见表6。

图4 微胶囊粉末脂肪酸组成

表6 产品及其原料油脂肪酸的测定结果

由表6可知，喷雾干燥包埋产品中芯材中油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳四烯酸和二十二碳六烯酸等主要脂肪酸含量均达到了母乳中相应脂肪酸含量水平，所以该乳液包埋调和油用于婴儿配方奶粉可为婴儿提供充足的能量，使配方奶粉贴近母乳，利于婴儿的生长需求。

3.5 微胶囊粉末在贮藏期间过氧化值变化

由于在油脂氧化过程中，过氧化物作为油脂氧化酸败的第一中间产物在不断的产生，所以通常情况下通过测定油脂中的过氧化值以检测油脂中过氧化物的含量。本试验中产品在贮存过程中每2 d测定1次，在贮存期间，65℃恒温培养箱中的产品的过氧化值是随着时间的增长而不断升高，同时过氧化值升高的速率在不断增加，在12 d之后过氧化值达到3.90 mmol／kg，该值小于国标中规定的不饱和脂肪酸含量较高的油料过氧化值不得超过6 mmol／kg。

3.6 微胶囊粉末的体外模拟消化试验

纳米乳液的消化经过口腔、胃、小肠3个部分，并主要在小肠部分完成，所以，本试验的体外消化模型只涉及小肠部分。该模型利用NaOH消耗量测定消化过程中游离脂肪酸的释放量［15-17］。

以未经处理调和油为对照组，比较纳米乳液与普通调和油的消化率。如图5，在禁食状态下，纳米乳液与普通调和油的游离脂肪酸释放量差异呈现先升高后下降的趋势，说明甘油三酯的消化主要集中在消化初期，之后随着时间的延长，纳米乳液与普通调和油的甘油三酯大部分被消化，所以游离脂肪酸释放量的差异减小，但纳米乳液中游离脂肪酸的释放量始终高于未处理调和油，在60 min时，纳米乳液中游离脂肪酸的释放量比未处理调和油组高37.03%。在喂食状态下，纳米乳液与普通调和油的游离脂肪酸释放量差异同样呈现先升高后下降的趋势，较禁食状态而言，其游离脂肪酸释放量差异更显著，高出禁食状态8%左右。这主要是由于在水相中的脂质消化的必要条件是油脂的乳化，并且胰脂肪酶在油水界面能发挥重要作用，而水包油型纳米乳液已经对油脂进行了初步乳化，此外，与普通调和油比较，纳米乳液的液滴与胰脂肪酶拥有更大的接触表面积，所以，纳米乳液的游离脂肪酸释放量高于未处理油脂。

图5 在禁食和喂食条件下纳米乳液与未处理油样的游离脂肪酸释放量差异

4 结论

本试验研究了乳化剂用量、超声时间和超声功率等因素对乳液粒径和喷雾干燥产品表面含油率的影响，利用响应面分析法优化了制备工艺，并对喷雾干燥产品进行表征。探讨了乳化剂用量、超声时间和超声功率对微胶囊各项特性影响的一般规律。

4.1 PC质量分数5.0%，超声功率660 W，超声时间20 min，在此条件下做3次验证试验，平均粒径为（184.37±0.64）nm，表面含油率为5.82%，与理论值较为接近，由此可知，依据此响应面模型数据可有效指导试验操作。

4.2 喷雾干燥所得产品呈乳白色、微粒状、流动性较好，具有乳清蛋白的清香。利用扫描电镜可以看出产品粉末呈球形，外观形态较好，过氧化值为1.94 mmol／kg。

4.3 纳米乳液经喷雾干燥所得产品的脂肪酸含量与未处理油样比较没有明显变化，说明样品的包埋效果较好，同时包埋产品的游离脂肪酸释放率明显高于未处理调和油，可以有效提高脂质的消化率，为婴儿提供充足的能量。

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Optimization of Process Parameters on the Preparation of Nutritional Oil Nano-Emulsion for Infant Formula Using Ultrasound

Li Ao Peng Kaidi Feng Wei Cheng Yina Zhu Aixia Wang Chunwei
（Wuhan Polytechnic University，College of Food Science and Engineering；School of Animal Science and Nutritional Engineering，Wuhan 430023）

To reduce the rate of oxidative rancidity of unsaturated fatty acid and improve digestion and absorption of nutritional oils for infant formula，nano-emulsion was obtained using the whey protein as wall material and the blend oil as oil phase via ultrasonic method.The microencapsulated blend oil from the nano-emulsion was prepared by spray-drying.On the basis of single factor test，response surface methodology was established using the particle size of emulsion as dependent variable，while emulsifier dosage，ultrasonic power and treatment time were used as independent variable.Results showed that the optimum conditions of preparation were as follow：emulsifier dosage mass fraction 5.0% （w／w，the total mass of solids），ultrasonic power 660 W，and ultrasonic time 20 min，the average particle size of emulsion was（184.37±0.64）nm and the surface oil content of products was 5.82%.On this basis，response surface model data could effectively guide the operation of this test.Product quality was good upon dry spraying，and the release amount of free fatty acids of nanoemulsion was higher than that in untreated blend oil during fasting and feeding based on an in vitro digestion method.

ultrasonic，nanoemulsion，spray drying，response surface test，in vitro digesting model

TS221

A

1003-0174（2017）03-0110-08

2015-07-09

李奥，男，1992年出生，硕士，食品科学

王春维，男，1958年出生，教授，粮油、食品、饲料资源开发