脂肪酶催化稻米油酯交换制备低热量结构脂及其动力学研究

赵 妍肖志刚，任海斌杨宏黎杨庆余白俊堃许 岩刘春景（东北农业大学食品学院，哈尔滨 50030）（沈阳师范大学粮食学院，沈阳 0034）

脂肪酶催化稻米油酯交换制备低热量结构脂及其动力学研究

赵 妍1肖志刚1，2任海斌1杨宏黎2杨庆余1白俊堃1许 岩1刘春景1
（东北农业大学食品学院1，哈尔滨 150030）
（沈阳师范大学粮食学院2，沈阳 110034）

以三丁酸甘油酯和稻米油为原料采用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM酯交换合成低热量结构脂，研究了底物质量比、酶添加量、反应温度、反应时间对结构脂转化率的影响，并以乒乓机制为动力学模型，建立脂肪酶催化制备结构脂的动力学方程。通过单因素试验确定最佳结构脂制备条件为底物质量比4∶1，酶添加量10%，反应温度50℃，反应时间24 h。三丁酸甘油酯与稻米油在无溶剂体系中的进行酯交换反应的初速度的动力学反应模型为V，经验证表明计算值与实验值较吻合，反应符合乒乓机制。

稻米油 酯交换 结构脂 动力学模型

短长链结构脂具有热量低，抑制体脂积累的特性，其合成方法主要有化学法和生物酶法，化学法反应条件剧烈且生成的产物随机，不能得到期望的产物［1-2］。酶法合成具有选择性高、副产物少、产物纯度高的特点。

而酶法合成主要集中于酸解法，其插入率较低，酰基转移率较高，而目前关于酯-酯交换的方法生产短长链结构脂研究较少［3-4］。近年来，酯-酯交换对油脂进行改性的工艺已在国外油脂生产中运用，例如低热量结构脂salatrim等。与传统酸解法相比，酯酯交换具有结构脂产率高且高氧化稳定性的特点［5］。

稻米油富含多不饱和脂肪酸，并且含有对人体有益的谷维素和维生素E、甾醇等成分［6-7］。三丁酸甘油酯具有修复小肠绒毛，抑制肠道有害菌的功效，并且对多种癌细胞如前列腺癌、乳腺癌等细胞增殖具有抑制作用［8-12］。以稻米油为甘油骨架，三丁酸甘油酯为酰基供体的结构脂生产方法鲜见报道。

本文采用稻米油和短链脂肪酸酯三丁酸甘油酯进行酶法酯交换，在固定化脂肪酶Lipozyme RM IM的催化条件下进行酶促酯交换，通过研究底物质量比、反应温度、反应时间、酶添加量等参数，探讨其对结构脂转化率的影响，并以乒乓机制的动力学模型为基础，研究了底物三丁酸甘油酯浓度对反应初速度的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

金龙鱼稻米油：市售；三丁酸甘油酯：上海源叶生物科技有限公司；Lipozyme RM IM：丹麦诺维信公司；色谱级乙腈、色谱级异丙醇、色谱级正己烷：山东禹王实业有限公司化工分公司。

1.2 试验仪器与设备

HZQ-C数显空气浴恒温振荡器：金坛市天竟实验仪器厂；KQ400-DE型数控超声波清洗器：昆山市超声波仪器有限公司；Agilent 1100LC高效液相色谱仪：郑州中谱仪器设备有限公司；DF110型电子分析天平：中国轻工机械总公司常熟衡器工业公司；Avan-ti J-26XP高速冷冻离心机：天津厚普生物技术开发有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酶促酯交换

将一定质量比的三丁酸甘油酯和稻米油放于圆底烧瓶内，混合均匀后加入一定量的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，于预定温度下的空气浴恒温振荡反应器内反应一定时间，反应结束后经离心过滤除去酶，样品密封保存于-20℃待检测分析。

1.3.2 结构脂含量检测

检测方法参考 Lisa［13］。准确称取一定量的样品，用乙腈-异丙醇-正己烷溶液（2∶2∶1 V／V）溶解至浓度为10 mg／ml，色谱条件：仪器：Agilent 1100LC高效液相色谱仪；色谱柱为 Agilent zorbax C18 （5 μm，4.6 mm×250 mm），紫外检测器（205 nm）。流动相为异丙醇 -乙腈（60∶40，V／V），流速：0.8 mL／min，柱温35℃，进样量，5 μL，分析时间25 min。

1.3.3 结构脂转化率测定

采用面积归一化法及理论碳数定性并计算LSL 及SLS型结构脂的含量。

酯交换程度=（反应后LSL及SLS型结构脂峰面积）／（样品中甘三酯峰面积总和）×100%

1.3.4 反应初速度测定

反应进行到30 min时取样检测，以单位时间里三丁酸甘油酯的总减少量作为酯交换反应的反应初速度［14］。

反应初速度计算V初=

式中：n为酯交换反应消耗三丁酸甘油酯的物质的量／mol；V为反应体系的总体积／L；t为反应时间／min。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 底物质量比对结构脂转化率的影响

选择三丁酸甘油酯与稻米油质量比分别为：1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，酶添加量10%，反应温度50℃，反应时间18 h考察底物质量比对结构脂转化率的影响。如图1所示。

从图1可以看出当底物质量比由1∶1增至4∶1时，结构脂转化率由36.32%升至55.48%，当底物质量比超过4∶1时，由于酶的缺乏，导致部分三丁酸甘油酯不能完全转化［15］。同时，随着三丁酸甘油酯的量的相对增长，副产物的含量也会增加。因此在保证结构脂的转化率及节约资源的前提下，选择底物质量比4∶1为最佳条件［16］。

图1 底物质量比和酶添加量对结构脂转化率的影响

2.1.2 酶添加量对结构脂转化率的影响

选择酶添加量为：4%、6%、8%、10%、12%5个水平，底物质量比3∶1，反应温度50℃，反应时间18 h考察酶添加量对结构脂转化率的影响。如图1所示。

从图1可以看出酶添加量的增加可以大大缩短酯交换反应到达平衡的时间，当酶添加量从4%增加到10%时，结构脂的转化率呈现线性增长的趋势，这与当前报道的结论相一致［17］。而当酶添加量超过10%时，结构脂的转化率基本保持不变，原因是尽管体系中酶添加量增加，但是能够发生酯交换反应的有效酶量却达到了“酶饱和”现象，而且过量的酶会影响酯交换反应进程中底物之间的传质效率，在其他的酯交换反应中也有研究发现类似的反应特点［18］。

2.1.3 反应温度对结构脂转化率的影响

选择反应温度为：40、45、50、55、60℃ 5个水平，底物质量比3∶1，酶添加量10%，反应时间18 h考察反应温度对结构脂转化率的影响。如图2所示。

图2 反应温度和反应时间对结构脂转化率的影响

从图2可以看出，在40～50℃时，随着反应温度的升高，结构脂的转化率呈上升趋势，原因可能是温度升高加速了分子间的重排速率，提高了酶的催化活性，但当反应温度过高时会导致酶的失活［19-21］。因此，考虑到反应速率以及酶的活性，50℃是Lipozyme RM IM酶催化三丁酸甘油酯和稻米油酯交换合成结构脂的最适温度。

2.1.4 反应时间对结构脂转化率的影响

选择反应时间为：6、12、18、24、30 h 5个水平，底物质量比3∶1、酶添加量：10%、反应温度：50℃考察反应时间对结构脂转化率的影响。如图2所示。

从图2中可以看出，在反应的前24 h内，反应速率呈现线性增长的趋势；在反应时间24 h后，反应速率增长趋势减缓，在 30 h后反应基本达到平衡［22-23］。从节约能源角度出发，24 h为反应最佳时间。

2.1.5 固定化脂肪酶的重复利用次数

研究固定化脂肪酶的重复利用次数可以很大程度上降低生产低热量结构脂的成本，本文采用多批次反应对固定化脂肪酶催化三丁酸甘油酯与稻米油酯交换制备低热量结构脂的催化活力稳定性进行研究，如图3所示，结果表明，随着反应批次的增长，由于酶活力的降低结构脂的转化率呈缓慢下降趋势，说明在无溶剂体系下固定化脂肪酶具有较好的操作稳定性，因此Lipozyme RM IM脂肪酶用于酯交换法合成低热量结构脂可以节约资源，具有良好的应用前景［24］。

图3 固定化脂肪酶Lipozyme RM IM的重复使用性

2.1.6 低热量结构脂HPLC分析

低热量结构脂经C18色谱柱分离后出峰顺序遵循当量碳数（ECN=CN-2DB，CN为酰基碳原子数、DB为双键数）的递增顺序。合成后结构脂各组分如图4所示，从左到右依次为SSS型甘油酯（1），SLS型甘油酯（2），LSL型甘油酯（3）以及少量的LLL型甘油酯（4、5、6、7、8、9、10、11），其中结构脂质量分数为57.14%，有利于进一步对其分子蒸馏纯化。

图4 结构脂HPLC分析图

2.2 动力学模型

固定化脂肪酶催化三丁酸甘油酯和稻米油的酯交换反应分为水解和酯化两个连续的步骤，符合双底物反应的乒乓机制［25］。在酯交换过程中可将稻米油中的甘油三酯视为一个整体与三丁酸甘油酯进行反应，为了方便酶促酯交换反应的动力学公式推导，将这个整体命名为B，三丁酸甘油酯命名为A。

苏定正等认为有意义的酯交换反应中所涉及的水解和酯化反应并不可逆［26-27］。因此，在动力学模型中忽略可逆反应。由此，固定化脂肪酶促米糠油和三丁酸甘油酯进行酯交换反应的反应初速度（V）动力学方程可由式（1）表示：

转化为倒数形式：

根据不同底物质量比得到不同Y值的基础上，利用最小二乘法计算出的理论值，由此可得KmA、KmB、Kmax，将其回代入方程（1）即可得到固定化脂肪酶促酯交换反应制备结构脂时，三丁酸甘油酯与稻米油生成低热量结构脂的反应初速度动力学方程［28］。

2.3 底物浓度对反应初速度的影响

将三丁酸甘油酯和稻米油分别按照质量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1进行酶促酯交换反应，30 min后测其反应初速度。根据动力学模型计算得出KmA= 0.169 2 mmol／g，KmB=0.148 6 mmol／g，Kmax=5.413× 10-3mmol／（g·min）。将其值代入方程，得到无溶剂体系中酶法酯交换合成低热量油脂的反应初速度的动力学方程为：

根据方程绘制曲线图。如图5所示，计算值和实验值相近，说明上述方程可以描述固定化脂肪酶催化三丁酸甘油酯与稻米油进行酯交换的反应初速度，高浓度的三丁酸甘油酯对反应初速度存在抑制作用，反应符合乒乓反应机制。

图5 三丁酸甘油酯浓度与反应初速度的关系

3 结论

对无溶剂体系中固定化脂肪酶催化三丁酸甘油酯和稻米油酯交换反应合成低热量结构脂进行了研究。研究表明在三丁酸甘油酯与稻米油底物质量比4∶1，酶添加量10%，反应温度50℃，反应时间24 h时为最佳工艺条件，结构脂转化率达57%，由双底物抑制的乒乓机制模型可以很好的描述脂肪酶催化稻米油和三丁酸甘油酯酯交换反应，且高浓度的三丁酸甘油酯对反应速率存在抑制作用。

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Research on Lipase Catalysis Rice Bran Oil for Exchange and Preparation of Low Calorie Structure Lipid and Dynamics

Zhao Yan1Xiao Zhigang1，2Ren Haibin1Yang Hongli2Yang Qingyu1Bai Junkun1Xu Yan1Liu Chunjing1
（College of Food Science，Northeast Agricultural University1，Haerbin 150030）
（College of Grain，Shenyang Normal University2，Shenyang 110034）

Taking the tributyrin and rice bran oil as raw materials，immobilized lipase and RM IM ester were used to exchange and compound low calories structure lipid，Effect of mass ratio of substrates，enzyme concentration，reac-tion temperature and reaction time on conversion rate of structure lipid，was researched.The kinetic equation of preparation of structure lipid was established based on taking Ping Pong mechanism as kinetic model.The optimal preparation conditions for structure lipid based on signal-factor experiment were mass ratio of substrates of 4∶1，enzyme dosage of 10%，reaction temperature of 50℃，reaction time of 24 h.The kinetic response model of initial velocity of interesterification between tributyrin and rice bran oil in the system without solvent was V=.The investigation indicated that calculated value was consistent with actual value and reaction accorded with Ping Pong mechanism.

rice bran oil，interesterification，structural lipid，kinetic model

TS2

A

1003-0174（2017）03-0042-06

“十二五”国家科技支撑计划（2012BAD34B02），黑龙江省教育厅科学技术研究重点项目（12511z006），哈尔滨市优秀学科带头人基金（2012 RFXXN107），辽宁省级公关项目（2014205007），沈阳市农业科技攻关（F14-104-3-00）

2015-07-28

赵妍，女，1991年出生，硕士，粮食油脂及植物蛋白工程

肖志刚，男，1972年出生，教授，粮食油脂及植物蛋白工程