亮氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响

赵艳丽 陈 璐 史彬林 郭晓宇 闫素梅

(内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特010018)

亮氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响

赵艳丽 陈 璐 史彬林 郭晓宇 闫素梅*

(内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特010018)

本试验旨在研究亮氨酸(Leu)对泌乳奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响，以探讨Leu对乳脂合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个处理，每个处理6个重复。6个处理培养液中Leu浓度分别为0.45、0.90、1.80、2.70、3.60和7.20 mmol/L，37 ℃、5% CO2培养48 h后测定BMECs内甘油三酯(TG)的含量及乳脂合成相关基因和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)与固醇调节元件结合蛋白(SREBP1)蛋白的相对表达量。结果显示：Leu浓度对BMECs内TG含量无显著影响(P>0.05)。适宜浓度的Leu显著促进脂肪酸合成酶(FASN)和乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)基因的表达(P<0.05)，FASN基因的相对表达量以1.80～2.70 mmol/L Leu处理、ACACA基因的相对表达量以1.80～7.20 mmol/L Leu处理较高。Leu浓度显著影响BMECs内SREBP1基因及蛋白表达(P<0.05)，以1.80 mmol/L Leu的促进效果最好。虽然Leu显著抑制BMECs内脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)、线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM)和嗜乳脂蛋白亚家族1成员1(BTN1A1)基因的表达(P<0.05)，但只有高浓度(3.60～7.20 mmol/L)的Leu抑制作用较大。综合来看，Leu浓度影响BMECs乳脂合成相关基因及PPARγ和SREBP1蛋白的表达。Leu浓度为1.80～2.70 mmol/L时，对脂肪酸从头合成相关基因及调控因子SREBP1蛋白表达的促进效果较好，对TG合成及脂滴形成相关基因表达的抑制作用较小。

奶牛；乳腺上皮细胞；亮氨酸；乳脂

牛奶总固形物中乳脂含量高达27%，是构成牛奶的重要物质基础，也是衡量乳品质的重要指标。氨基酸(AA)作为乳蛋白合成的主要前体物，不仅影响乳蛋白合成，对乳脂的合成也有影响[1]，因此，深入研究AA对乳脂合成的影响及其机理对改善乳品质有重要的意义。亮氨酸(Leu)是动物的必需氨基酸，研究发现，小鼠饲粮缺乏Leu后其白色脂肪组织中的脂肪合成受限制，脂肪酸合成酶(FASN)和乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)基因以及固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP1c)和FASN蛋白的表达显著下降，血清游离脂肪酸和甘油的含量也显著下降[2]。体外研究发现，Leu在影响乳蛋白合成的同时，也促进奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP1)基因的表达和甘油三酯(TG)的合成[3]。这些结果提示Leu可能通过影响脂肪合成相关基因的表达促进脂肪合成。然而，采食高脂饲粮的小鼠摄入过量的Leu后，其体重下降，脂肪合成受抑制[4]。也有研究发现小鼠日摄入需要量2倍以上的Leu对血浆胆固醇和TG的合成无显著的影响[5]。可见，Leu对动物脂肪代谢的影响在不同的组织中不完全一样，有关Leu对奶牛乳脂合成的影响及其机理的研究报道很少。鉴于此，本试验以BMECs为模型，研究不同浓度Leu对乳脂合成相关基因及蛋白表达的影响，为进一步探讨Leu对乳脂合成的影响机理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

1.2 试剂配制

生长培养基的配制：在100 mL的DMEM/F12基础培养基中添加10%胎牛血清、1%胰岛转铁蛋白、1 μg/mL氢化可的松、0.5%胰岛素转铁蛋白硒钠、10 ng/mL表皮生长因子、5 μg/mL催乳素、100 μg/mL链霉素、100 IU/mL青霉素和2.5 μg/mL两性霉素B。

Leu工作液的配制：称取0.118 g的Leu粉末溶于10 mL无血清的生长培养基中，配成浓度为90 mmol/L的Leu贮备液，0.22 μm滤器过滤。用无血清的生长培养基按照梯度稀释法将90 mmol/L的Leu贮备液根据试验要求配制成不同Leu浓度的细胞培养液。

1.3 BMECs的培养

采用胶原酶消化法培养BMECs，具体方法参照Sheng等[6]的方法进行。从内蒙古呼和浩特市北亚清真屠宰场选取3～5岁经产的健康泌乳中期的高产荷斯坦奶牛乳腺组织，0～4 ℃条件下运回实验室。从深层取约1 cm3组织块放入3×双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)中。随后分别用3×双抗的PBS、75%酒精和1×PBS清洗。将腺泡丰富的组织剪成糊状后加入等体积0.5%的Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化1 h。80目滤网过滤后，179×g离心5 min，弃上清；PBS冲洗细胞，179×g离心3 min，重复冲洗2次。用生长培养基悬浮接种于25 cm2透气培养瓶中，于37 ℃、5% CO2条件下培养，直至原代细胞贴壁率达约90%后用0.05%胰蛋白酶-EDTA纯化和传代细胞。

1.4 试验设计

收集第3代BMECs并悬浮于生长培养基中按照试验要求的密度接种于细胞培养板上，于37 ℃、5% CO2培养24 h。试验采用单因子随机试验设计，将BMECs培养24 h后随机分为6个处理，每个处理6个重复。细胞培养液中Leu的浓度是参考庞学燕[7]和代文婷等[8]的研究结果，然后利用噻唑蓝(MTT)法通过细胞的增殖率确定，6个处理Leu的浓度分别为0.45、0.90、1.80、3.60、2.70和7.20 mmol/L，每个处理6个重复。在BMECs贴壁率为80%～90%时，换为无血清的生长培养基，12 h后按照试验设计要求换为不同Leu浓度的细胞培养液，37 ℃、5% CO2培养48 h。

1.5 测试指标与方法

1.5.1 BMECs内TG含量的测定

BMECs内TG的含量参考Ramírez-Zacarías等[9]的方法测定，用吸光度(OD)值表示其含量，具体方法：将细胞悬液以5×104个/mL的密度接种于24孔培养板，按试验设计培养48 h后，弃培养液，PBS漂洗2次，每孔加入4%多聚甲醛溶液0.2 mL固定细胞1 h后，PBS漂洗2次，0.5 mL油红O工作液避光浸染2 h。然后用PBS漂洗3次，晾干培养板后，加入0.3 mL异丙醇萃取30 min，用全自动酶标仪在波长为510 nm处测定其OD值。

1.5.2 BMECs内乳脂合成相关基因表达的测定

表1 乳脂合成相关基因的引物序列

续表1基因GenesGenBank登录号GenBankaccessionNo.引物序列Primersequences(5'—3')长度Length/bp参考文献ReferencesXDHBC102076F:GATCATCCACTTTTCTGCCAATGR:CCTCGTCTTGGTGCTTCCAA100自行设计

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶 glycerol phosphate dehydrogenase；FASN：脂肪酸合成酶 fatty acid synthase；ACACA：乙酸辅酶A羧化酶A acetyl-coenzyme A carboxylase α；SCD1：硬脂酰辅酶A去饱和酶1 stearoyl-CoA desaturase 1；FABP3：脂肪酸结合蛋白3 fatty acid-binding protein 3；LPL：脂蛋白脂酶 lipoprotein lipase；PPARγ：过氧化物酶体增殖物激活受体γ peroxisome proliferator-activated receptor gamma；SREBP1：固醇调节元件结合蛋白1 sterol regulatory element binding protein 1；AGPAT6：乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 6；GPAM：线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶 mitochondrial glycerol-3-phosphate acyltransferase；LPIN1：磷脂酸磷酸酯酶 1 phosphatidic acid phosphatase 1；BTN1A1：嗜乳脂蛋白亚家族1成员1 butyrophilin subfamily 1 member A1；XDH：黄嘌呤脱氢酶 xanthine dehydrogenase。表2同 The same as Table 2。

1.5.3 BMECs内乳脂合成相关蛋白表达的测定

BMECs内乳脂合成相关蛋白的表达采用蛋白质免疫印迹(Western blotting)的方法测定。将细胞悬液以1×106个/mL的密度接种于25 cm2细胞培养瓶，按试验设计培养48 h后，弃上清，PBS清洗贴壁生长的细胞2次，弃去上清，加入含0.1%PMSF的RIPA细胞裂解液250 μL，4 ℃裂解5 min后收集细胞悬液，4 ℃、15 455×g离心10 min，收集上清液检测PPARγ和SREBP1蛋白的表达。将60 μg待检测蛋白样品与5×上样缓冲液按照4∶1的比例混合，100 ℃变性5 min后进行电泳，于浓缩胶上80 V电泳40 min，分离胶上120 V电泳100 min。目的蛋白经电泳分离后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。转膜完成后，用蒸馏水冲洗1 min，室温封闭1 h后，TBST洗涤3次，每次2 min。然后分别用兔抗PPARγ(1∶250)和鼠抗SREBP1(1∶50)于4 ℃孵育过夜，取出PVDF膜后TBST洗涤3次，每次5 min。分别用山羊抗兔二抗(1∶1 000)和山羊抗鼠二抗(1∶500)室温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次8 min。用ECL化学超敏显色液进行显色，凝胶成像仪上照相分析(Tanongis-1000，上海天能生物科技公司)。图片用Quantity one软件进行灰度值分析，PPARγ和SREBP1蛋白的相对表达量采用各处理与Leu浓度为0.45 mmol/L的处理的比值表示。

1.6 数据处理

所有数据利用Excel 2007进行计算和整理，采用SAS 9.0软件的回归统计程序进行一次线性与二次曲线回归分析，P<0.05表示回归关系显著，0.05≤P<0.10表示回归关系趋于显著。

2 结 果

2.1 Leu对BMECs内TG含量和乳脂合成相关基因表达的影响

由表2可知，不同浓度(0.45～7.20 mmol/L)Leu处理的BMECs内TG含量差异不显著(P>0.05)，但0.90～2.70 mmol/L Leu处理的TG含量在数值上高于其他处理。随着Leu浓度的增加，BMECs内FABP3基因的相对表达量呈显著的一次线性下降(P=0.018)，LPL基因的相对表达量呈显著的二次曲线下降(P=0.016)，二者在3.60～7.20 mmol/L Leu处理的相对表达量均较低；BMECs内FASN和ACACA基因的相对表达量均呈显著的二次曲线增加(P=0.013、P=0.002)，FASN基因的相对表达量以1.80～2.70 mmol/L Leu处理较高，7.20 mmol/L Leu处理较低；BMECs内ACACA基因的相对表达量以1.80～7.20 mmol/L Leu处理较高，其他处理均较低。BMECs内SCD1和PPARγ基因的相对表达量与Leu浓度无显著的回归关系(P>0.05)，但从数值上看，PPARγ基因的相对表达量以0.90～2.70 mmol/L Leu处理较高，7.20 mmol/L Leu处理最低。BMECs内SREBP1基因的相对表达量随Leu浓度的增加呈显著的二次曲线增加(P=0.022)，以1.80 mmol/L Leu处理的相对表达量最高，7.20 mmol/L Leu处理的相对表达量最低。BMECs内AGPAT6、GPAM、LPIN1和BTN1A1基因的相对表达量随Leu浓度的增加呈显著的一次线性下降(P=0.018、P=0.032、P=0.034、P<0.001)，以0.45～2.70 mmol/L Leu处理的AGPAT6、GPAM和BTN1A1基因的相对表达量较高，以0.45～1.80 mmol/L Leu处理的LPIN1基因的相对表达量较高。BMECs内XDH基因的相对表达量与Leu浓度无显著的回归关系(P>0.05)。

表2 Leu对BMECs内TG含量和乳脂合成相关基因表达的影响

P<0.05表示回归关系显著；0.05≤P<0.10表示回归关系趋于显著。下表同。

P<0.05 means regression relationship was significant; 0.05≤P<0.10 means regression relationship tend to be significant. The same as below.

2.2 Leu对BMECs内乳脂合成相关蛋白表达的影响

由表3和图1可知，BMECs内PPARγ蛋白的相对表达量与Leu浓度无显著的剂量依赖关系(P>0.05)，但从数值上看，以0.90～2.70 mmol/L Leu处理的相对表达量较高，3.60～7.20 mmol/L Leu处理的相对表达量较低。BMECs内SREBP1蛋白的相对表达量随着Leu浓度的增加呈显著的二次曲线增加(P=0.032)，以0.90～3.60 mmol/L Leu处理的相对表达量较高，且尤以1.80 mmol/L Leu处理的相对表达量最高，以7.2 mmol/L Leu处理的相对表达量最低。

表3 Leu对BMECs内乳脂合成相关蛋白表达的影响

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶 glycerol phosphate dehydrogenase；PPARγ：过氧化物酶体增殖物激活受体γ peroxisome proliferator-activated receptor gamma；SREBP1：固醇调节元件结合蛋白1 sterol regulatory element binding protein 1。

图1 Leu对BMECs内乳脂合成相关蛋白表达的影响

Fig.1 Effects of Leu on expression of proteins related with milk fat synthesis in BMECs

3 讨 论

细胞内脂肪酸的自由扩散效率较低，而且不具有生物靶向性，所以大部分脂肪酸的靶向性运输都需要相关转运蛋白的参与[14]。LPL和FABP3基因是参与哺乳动物多种组织中长链脂肪酸(LCFA)摄取与细胞内转运的重要基因[15]。在玉米秸秆为粗饲料的条件下，奶牛阴外动脉灌注AA后，乳腺对LCFA的摄取及乳脂中的C18∶0、c-9,c-12-C18∶2和C18∶3含量也下降[16]。本研究结果得出，随着Leu浓度的增加，BMECs内FABP3和LPL基因的相对表达量下降，说明Leu可能抑制BMECs内LCFA的摄入与转运。目前，关于Leu对FABP3和LPL基因表达影响的研究报道极少，有待于进一步研究探讨。

固醇调节元件结合蛋白(SREBP)和PPARγ是乳脂合成的重要调控因子。沉默BMECs内SREBP1基因后，ACACA和FASN基因的相对表达量显著下降[17]。用PPARγ的激活剂罗格列酮处理BMECs后，FASN和ACACA基因的相对表达量增加[18]。ACACA是脂肪酸从头合成的一种限速酶，催化乙酰-辅酶A(CoA)羧化生成丙二酰CoA。FASN是一种多功能的酶系统，以一种代谢酶类参与脂肪的生成和沉积，是体内脂肪合成途径中的一个关键酶。在泌乳期间乳腺内FASN基因编码的蛋白FASN调控中短链脂肪酸(SMCFA)(C4～C16)的合成[19]。Cheng等[2]的研究发现，小鼠饲粮缺乏Leu后白脂肪组织中FASN和ACACA基因的相对表达量以及FASN和SREBP1c蛋白的相对表达量显著下降。另有研究发现，Leu上调BMECs内SREBP1基因的表达[3]。本研究结果显示，1.8～2.7 mmol/L的Leu可上调SREBP1和PPARγ基因和蛋白的表达，其靶基因ACACA和FASN的表达也上调。这说明Leu对乳脂的合成有显著的影响，且SREBP1和PPARγ可能参与Leu对乳脂合成的调控；此外，Leu对乳脂合成的影响与剂量有关，1.8～2.7 mmol/L的Leu可促进SMCFA的合成。

GPAM、AGPAT6和LPIN1是参与TG合成的主要基因，同时其编码的蛋白也是参与乳脂合成的关键酶[20]。GPAM催化脂酰CoA结合到甘油-3-磷酸的sn-1位点形成溶血磷脂酸，AGPAT催化第2个脂酰辅酶A结合到甘油-3-磷酸的sn-2位点形成磷脂酸。LPIN1能转移磷酸基团，将磷脂酸转变成二酰甘油，然后，另外一个脂酰CoA酯化到甘油的sn-3位点形成TG。乳腺细胞内的TG在一系列蛋白的作用下形成脂滴。BTN1A1和XDH是参与脂滴形成的主要蛋白[21]。BTN1A1在乳腺细胞分泌时帮助形成乳脂滴，XDH在乳脂肪球和细胞顶膜偶联过程中起重要作用。Leu、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)等支链氨基酸(BCAA)对饲喂高脂饲粮的小鼠肥胖和脂肪代谢平衡具有一定影响，BCAA组小鼠肝脏和肌肉中TG的含量较对照组显著降低[22]。然而，日摄入2倍以上需要量的Leu对小鼠血浆胆固醇和TG的合成无显著的影响[5]。这些研究结果说明Leu对TG合成的影响结果不尽一致。本研究结果表明，高浓度(3.60～7.20 mmol/L)Leu尽管抑制GPAM和AGPAT6基因的表达，但对TG的合成并没有显著的抑制效果；结果也得出Leu促进了脂肪酸的从头合成，但抑制了与LCFA的摄取与转运有关的基因的表达，这可能是导致其对TG合成影响不显著的主要原因。本研究还得出，高浓度Leu下调脂滴形成相关基因BTN1A1基因的表达。在奶山羊BMECs内，FASN基因干扰后BTN1A1基因的相对表达量和脂滴形成数量显著下降[23]，说明高浓度Leu处理BMECs内BTN1A1基因表达的下调可能与FASN基因表达的下调有关。综合结果得出Leu对脂肪酸从头合成基因FASN和ACACA基因的表达均具有促进作用，且呈剂量依赖关系，FASN基因的表达以1.80～2.70 mmol/L的Leu促进效果较好，ACACA基因的表达以1.80～7.20 mmol/L的Leu促进效果较好；Leu上调SREBP1基因及蛋白的表达，1.80 mmol/L的Leu促进效果最好；Leu抑制FABP3、LPL、AGPAT6、GPAM和BTNIA1基因的表达，但只在添加高浓度(3.60～7.20 mmol/L)的Leu时抑制作用较大。综合乳脂合成的多项指标，Leu浓度为1.80～2.70 mmol/L效果较好。

4 结 论

Leu浓度为1.80～2.70 mmol/L时，对BMECs内FASN、ACACA和SREBP1基因及SREBP1蛋白表达的促进效果较好，对TG合成及脂滴形成相关基因的表达抑制作用较小。

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*Corresponding author, professor, E-mail: yansmimau@163.com

(责任编辑 菅景颖)

Effects of Leucine on Expression of Genes and Proteins Related with Milk Fat Synthesis in Bovine Mammary Epithelial Cells

ZHAO Yanli CHEN Lu SHI Binlin GUO Xiaoyu YAN Sumei*

(CollageofAnimalScience,InnerMongoliaAgricultureUniversity,Hohhot010018,China)

The objects of this study were to study the effects of leucine (Leu) on expression of genes and proteins related with milk fat synthesis in bovine mammary epithelial cells (BMECs), in order to investigate the mechenism of Leu regulating milk fat synthesis. The third generation of BMECs were divided into six treatments with six replicates per treatment, and cultured in culture mediums with 0.45, 0.90, 1.80, 2.70, 3.60 and 7.20 mmol/L Leu, respectively. The triglyceride (TG) content, the relative expression levels of genes related with milk fat synthesis, as well as the protein relative expression levels of peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ) and sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1) in BMECs after 48 h incubation at 37 ℃ and 5% CO2were detected. The results showed that the Leu concentration had no significant effect on TG content in BMECs (P>0.05). The optimal Leu concentration significantly up-regulated the gene expression of fatty acid synthase (FASN) and acetyl-CoA carboxylase A (ACACA) in BMECs (P<0.05). The higher gene relative expression level ofFASNwas observed in 1.80 to 2.70 mmol/L Leu treatments, and the higher gene relative expression level ofACACAwas observed in 1.80 to 7.20 mmol/L Leu treatments. Leu concentration significantly increased the gene and protein expression ofSREBP1 in BMECs (P<0.05), and the best promoting effect was observed in 1.80 mmol/L Leu treatment. Although Leu significantly inhibited the gene expression of fatty acid-binding protein 3 (FABP3), lipoprotein lipase (LPL), 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 6 (AGPAT6), mitochondria glycerol-3-phosphate acyltrandferase (GPAM) and butyrophilin subfamily 1 member A1 (BTN1A1)in BMECs (P<0.05), the higher inhibiting effect was only observed in high Leu concentration (3.60 to 7.20 mmol/L) treatments. Taken together, Leu concentration has a significant effect on the expression of genes related with milk fat synthesis and protein expression of PPARγ and SREBP1 in BMECs. The 1.80 to 2.70 mmol/L Leu has a better promoting effect ondenovofatty acid synthesis genes and SREBP1 protein expression, as well as little inhibiting effect on the expression of genes involved in TG synthesis and lipid droplet formation.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1319-1326]

dairy cow; bovine mammary epithelial cells; leucine; milk fat

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.029

2016-09-28

国家奶业“973计划”项目(2011CB1008003)

赵艳丽(1986—)，女，陕西榆林人，博士研究生，从事奶牛乳腺上皮细胞内乳脂乳蛋白合成调控研究。E-mail： ylzhao2010@163.com

*通信作者:闫素梅，教授，博士生导师，E-mail： yansmimau@163.com

S827

A

1006-267X(2017)04-1319-08