高效液相色谱法测定食品接触材料食品模拟物中三聚氰胺含量的不确定度评定

李灿明，柏建国

（奥瑞金包装股份有限公司，北京，101407）

高效液相色谱法测定食品接触材料食品模拟物中三聚氰胺含量的不确定度评定

李灿明，柏建国

（奥瑞金包装股份有限公司，北京，101407）

以JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》为依据，对高效液相色谱法测定食品接触材料食品模拟物中三聚氰胺含量进行不确定度评定，结果显示四种食品模拟物中三聚氰胺含量分别为0.502±0.023 mg/L（水）、0.298±0.023mg/L（10%乙醇）、7.027±0.34mg/L（3%乙酸）和0.637±0.046 mg /kg（玉米油），其相对标准不确定度均小于10%。

高效液相色谱，食品接触材料，三聚氰胺，不确定度

三聚氰胺，俗称密胺，是一种重要的食品接触材料添加剂，常用于塑料、涂料和粘合剂的生产，广泛应用于塑料类、金属涂层类和纸类等食品接触材料。由于该类食品接触材料中残留的三聚氰胺单体与食品接触时有可能迁移至食品中[1-4]，鉴于此，GB 9685-2008中规定了三聚氰胺的最大迁移限量为1mg/kg[5]。本文以GB/T 23296.15-2009《食品接触材料 高分子材料 食品模拟物中2，4，6-三氨基-1， 3，5-三嗪（三聚氰胺）的测定 高效液相色谱法》为参考检测方法[6]，以JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》为测量不确定度评定依据[7]，对GB/ T 23296.15-2009中的水、10%乙醇、3%乙酸和玉米油等四种食品模拟物中三聚氰胺含量的测定进行不确定度评定，以期为测量结果质量的评定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料

1.1.1.1 三聚氰胺（纯度≥99%）；

1.1.1.2 实验用食品模拟物样品：本实验室的某种食品接触材料经水、10%乙醇、3%乙酸和玉米油浸泡处理后获得的食品模拟物样品，并分别在该四种样品中加入了适量的三聚氰胺标品，充分混匀。

1.1.2 仪器

1.1.2.1 液相色谱（附DAD检测器）：Agilent 1290 Infinity；

1.1.2.2 电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，AL204型，感量0.0001g；

1.2 方法

本实验参考有关国家标准[6]，对食品模拟物样品中三聚氰胺的含量进行检测。

1.2.1 标准贮备液的配制

准确称取三聚氰胺标准品50.0mg（精确至0.1mg），置于50mL容量瓶中，加入40mL水，在水浴（温度为70℃）中超声15～30min，使三聚氰胺能够充分溶解，冷却至室温后用水定容，即为1000mg/ L标准贮备液。

1.2.2 标准曲线

1.2.2.1 水基食品模拟物

用水基食品模拟物（水、10%乙醇、3‰乙酸）将标准贮备液逐级稀释得到浓度为100、200、400、600、800、1000μg/L的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。

1.2.2.2 玉米油

1.2.2.2.1标准溶液配制

（1）低浓度标准溶液（25mg/L）：量取2.5mL标准贮备液置于100mL容量瓶中，用水定容，混合均匀。

（2）异丙醇-水混合溶液配制的三聚氰胺标准溶液：分别量取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、1.0 mL、2.0mL、4.0 mL低浓度标准溶液（25mg/L）于10mL容量瓶中，每个容量瓶中加入5mL异丙醇，用水定容，得到三聚氰胺浓度分别为250μg/L、500μg/L、1000μg/L、2500μg/L、5000μg/L、10000μg/L。

（3）玉米油标准工作溶液：分别准确称取5g（精确至0.1g）玉米油于6个25mL具塞试管中，向每个试管中依次加入1mL异丙醇-水溶液配制的三聚氰胺标准溶液，充分混合，得到玉米油中三聚氰胺浓度为50 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg、500 μg/ kg、1000 μg/kg和2000 μg/kg。在每个试管中再加入5mL异辛烷和4.0mL水，在恒温水浴中（70℃）超声萃取约30min，静置3min使两项分层，用移液器吸取下层水溶液2mL，通过0.2μm滤膜过滤后供液相色谱进样。

1.2.2.2.2标准曲线绘制

对玉米油标准工作溶液进行液相检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。

1.2.3 样品处理

1.2.3.1 水和10%乙醇

量取水基食品模拟物样品（水和10%乙醇）1mL，通过0.2μm滤膜过滤后供液相色谱进样。

1.2.3.2 3%乙酸

准确量取水基食品模拟物样品（3%乙酸）1mL于10mL容量瓶中，用水定容，充分混合。用移液器吸取混合液2mL，通过0.2μm滤膜后供液相色谱进样。

1.2.3.3 玉米油

准确称取玉米油模拟物样品5g（精确至0.1g）于25mL具塞试管中，加入5mL异辛烷，充分混合，再加入5mL10%（体积分数）的异丙醇溶液，将试管放到恒温水浴中（温度70℃）超声萃取约30min，然后静置3min使两项分层，用移液器吸取下层水溶液2mL，通过0.2μm滤膜后供液相色谱进样。

1.2.4 色谱条件

色谱柱：Hilic Plus，2.1×100mm，1.8μm；

流动相：磷酸缓冲溶液（0.005moL/L，pH=6.5）+乙腈=22+78；

流速：0.3mL/min；

进样量：1μL；

柱温箱温度：35℃；

检测波长：205nm。

1.2.5 测定

式中：X-食品模拟物中三聚氰胺的含量，单位mg/L或mg/kg；

C样-从标准曲线上查出的进样溶液中三聚氰胺的浓度，单位mg/L；

V定-定容体积，单位mL；

V样 - 食品模拟物取样量，单位mL或g。

1.2.6 测定结果（表1）

2 不确定度的来源

测定过程中不确定度主要来源：（1）标准曲线所得的样品浓度引起的不确定度（uC样），包括标准贮备液配制、标准曲线溶液稀释和标准曲线拟合所得样品浓度引起的不确定度；（2）样品取样引起的不确定度（uV样）；（3）处理定容引起的不确定度（uV定）；（4）结果修约引起的不确定度（u修约）。不确定度分量汇总表如表a和表b所示。根据以上分析，结合测定公式，可知：

表1 测定结果

表a 不确定度分量汇总表（水基食品模拟物）

表b 不确定度分量汇总表（玉米油）

3 不确定度的评定

3.1测试导致的不确定度

3.1.1 测试试样溶度引入的不确定度

3.1.1.1 三聚氰胺标准贮备液配制引起的不确定度

① 三聚氰胺纯度引起的不确定度

依据三聚氰胺标品标签，其纯度≥99%，故其区间半宽为（1-99%）/2=0.5%，按均匀分布，由标准品纯度引入的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

② 称量引起的不确定度

称量时，天平的分辨力为0.0001g，区间半宽为0.0001/2=0.00005g，按均匀分布，由分辨力引起的标准不确定度为：

此外还有天平的准确性引入的不确定度，依据检定证书，电子天平在该称量范围的最大允差为±0.0005g，按均匀分布，则其标准不确定度为：

将上述两项不确定度合成，由称量引起的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

2.901×10-4/0.0500 = 5.802×10-3

③ 体积引起的不确定度

配制标准贮备液时使用50mL容量瓶，允差±0.10mL，按均匀分布，其标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

0.0577/50= 1.154×10-3

由以上三项合成可得标准贮备液配制引起的相对标准不确定度为：

urel(储备液)=

=6.589×10-3

3.1.1.2标准储备液稀释引入的不确定度

3.1.1.2.1水基食品模拟物

① 刻度吸管引起的不确定度

刻度吸管1mL、2mL、5mL、10mL，允差分别为±0.015mL、±0.025mL、±0.050mL、±0.10mL，按均匀分布，其标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

合成相对标准不确定度为：

② 容量瓶引起的不确定度

配制标准曲线溶液使用容量瓶10mL和1000mL，允差分别为±0.040mL和±0.80mL，按均匀分布，其标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

合成相对标准不确定度为：

由以上可得标准储备液稀释引起的相对标准不确定度为：

3.1.1.2.2玉米油

① 低浓度标准溶液（25mg/L）配制引起的不确定度

配制该溶液使用了5mL移液枪和100mL容量瓶，允差分别为±（2.5×0.5%）mL和±0.20mL，按均匀分布，其标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

合成相对标准不确定度为：

② 异丙醇-水混合溶液配制三聚氰胺标准溶液引起的不确定度

配制该溶液使用了100μL、1mL、5mL移液枪和10mL容量瓶，允差分别为：

按均匀分布，其标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

合成相对标准不确定度为：

③ 玉米油标准工作溶液配制引起的不确定度

配制该溶液使用了1mL和5mL移液枪，允差分别为：

按均匀分布，其标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

合成相对标准不确定度为：

由以上可得标准储备液稀释引起的相对标准不确定度为：

3.1.1.3 标准曲线拟合所得样品浓度引起的不确定度

3.1.1.3.1水

由表2可得，峰面积标准偏差为：

标准溶液浓度偏差的平方和为：

则曲线拟合所得样品浓度x0的标准不确定度为：

式中n为曲线拟合时标准溶液测定的次数，本次测定为6，p为样品测定的次数，本次测定为6次，a为斜率。

相对标准不确定度为：

3.1.1.3.2 10% 乙醇

表1 标准曲线浓度-峰面积结果

表2 标准曲线上所得值与实际测量值之间的标准偏差及标准偏差平方和

表3 标准曲线浓度-峰面积结果

表4 标准曲线上所得值与实际测量值之间的标准偏差及标准偏差平方和

注：yj=0.068448xi + 0.017431

由上表可得，峰面积标准偏差为：

标准溶液浓度偏差的平方和为：

则曲线拟合所得样品浓度x0的标准不确定度为：

式中n为曲线拟合时标准溶液测定的次数，本次测定为6，p为样品测定的次数，本次测定为6次，a为斜率。

相对标准不确定度为：

3.1.1.3.3 3%乙酸

表5 标准曲线浓度-峰面积结果

表6 标准曲线上所得值与实际测量值之间的标准偏差及标准偏差平方和

由上表可得，峰面积标准偏差为：

标准溶液浓度偏差的平方和为：

则曲线拟合所得样品浓度x0的标准不确定度为：

式中n为曲线拟合时标准溶液测定的次数，本次测定为6，p为样品测定的次数，本次测定为6次，a为斜率。

相对标准不确定度为：

urel(拟合)=3.754/703 =5.340×10-3

3.1.1.3.4玉米油

由表8可得，峰面积标准偏差为：

标准溶液浓度偏差的平方和为：

则曲线拟合所得样品浓度x0的标准不确定度为：

式中n为曲线拟合时标准溶液测定的次数，本次测定为6，p为样品测定的次数，本次测定为6次，a为斜率。

相对标准不确定度为：

urel(拟合)=16.331/637 =2.564×10-2

由以上分析可知，由标准曲线所得样品浓度引起的不确定为：

水：

表7 标准曲线浓度-峰面积结果

表8 标准曲线上所得值与实际测量值之间的标准偏差及标准偏差平方和

10%乙醇：

3%乙酸：

玉米油：

3.1.2 测试试样溶液取样量不准确引入的不确定度

3.1.2.1水和10%乙醇

检测水和10%乙醇模拟物样品时，取样不会产生不确定度。

3.1.2.2 3%乙酸

样品取样时，使用了1mL移液枪，允差为±（1×1%）=±0.01mL，按均匀分布，其标准不确定度为：

1mL移液枪的分辨力为0.001mL，区间半宽为0.001/2=0.0005mL，按均匀分布，由移液枪分辨力引起的标准不确定度为：

将上述两项不确定度合成，由取样引起的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

urel(v样)=5.781×10-3 /1=5.781×10-3

3.1.2.3玉米油

样品称量时，天平的分辨力为0.0001g，区间半宽为0.0001/2=0.00005g，按均匀分布，由分辨力引起的标准不确定度为：

此外还有天平的准确性引入的不确定度，依据检定证书，电子天平在该称量范围的最大允差为±0.0005g，按均匀分布，则其标准不确定度为：

将上述两项不确定度合成，由称量引起的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

3.1.3测试试样溶液定容体积不准确引入的不确定度

3.1.3.1水和10%乙醇

检测水和10%乙醇模拟物样品时，没有定容这一步骤，故不会产生不确定度。

3.1.3.2 3%乙酸

样品定容使用10mL容量瓶，由定容导致的标准不确定度包含了：

A、定容时的估读误差（分辨力）：

容量瓶的分辨力为0.1mL，其标准不确定度为

B、标称容量的偏倚：

样品定容使用10mL容量瓶，根据检定规程其允差为±0.040mL，按三角分布，其标准不确定度为：

C、体积变化导致的标准不确定度

根据检定规程JJG196-2006《常用玻璃量器》中6.2，其标定的容积为20摄氏度时的容积，然而实验室的温度变化范围为18至26摄氏度，距20摄氏度的最大温差为6摄氏度，由于温度变化而导致体积变化，体积变化量服从均匀分布，正已烷液体体积膨胀系数为1.8×10-3/℃，由此导致的标准不确定度为：将上述三项合成，由定容引起的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

3.1.3.3玉米油

样品定容使用5mL移液枪，允差为±（5×0.6%）=±0.03mL，按均匀分布，其标准不确定度为：

5mL移液枪的分辨力为0.005mL，区间半宽为0.005/2=0.0025mL，按均匀分布，由移液枪分辨力引起的标准不确定度为：

将上述两项不确定度合成，由定容引起的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

3.2 三聚氰胺含量结果修约导致的不确定度

4 合成不确定度

4.1 水

4.2 10%乙醇

4.3 3%乙酸

4.4 玉米油

5 扩展不确定度

5.1 水

取扩展因子k=2，扩展不确定度U(X)=2×uc(X) =2×0.01116=0.02232≈0.023mg/L

5.2 10%乙醇

取扩展因子k=2，扩展不确定度U(X)=2×uc(X) =2×0.01141=0.02282≈0.023mg/L

5.3 3%乙酸

取扩展因子k=2，扩展不确定度U(X)=2×uc(X) =2×0.1694=0.3388≈0.34mg/L

5.4 玉米油

取扩展因子k=2，扩展不确定度U(X)=2×uc(X) =2×0.02279=0.04558≈0.046mg/L

6 结果

6.1 水

样品测定结果为：X =0.502±0.023 mg/L

6.2 10%乙醇

样品测定结果为：X = 0.298±0.023mg/L

6.3 3%乙酸

样品测定结果为：X = 7.027±0.34mg/L

6.4 玉米油

样品测定结果为：X = 0.637±0.046 mg /kg

7 结语

本文以GB/T 23296.15-2009《食品接触材料 高分子材料 食品模拟物中2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪（三聚氰胺）的测定 高效液相色谱法》为参考检测方法，以JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》为依据，对食品接触材料迁移实验得到的四种加标食品模拟物（水，10%乙醇，3%乙酸，玉米油）进行三聚氰胺含量检测，并对其测量不确定度进行来源分析和评定。结果显示四种食品模拟物中三聚氰胺含量分别为0.502±0.023 mg/L（水）、0.298±0.023mg/L（10%乙醇）、7.027±0.34mg/L（3%乙酸）和0.637±0.046 mg /kg（玉米油），其相对标准不确定度均小于10%。

[1]段文仲,马育松,陈瑞春,等．食品中三聚氰胺污染途径及控制对策研究[J]．食品科学,2010,31（1）：283-286．

[2]郝倩,苏荣欣,齐崴,等．食品包装材料中有害物质迁移行为的研究进展[J]．食品科学,2014,35(21)：279-282．

[3]陈英,范雨豪,刘志刚,等．酸性环境下金属三片罐涂层中三聚氰胺迁移规律[J]．食品与机械,2016,32(1)： 46-50．

[4]徐彦辉,陈戈,顾亮,等．金属罐内层涂料三聚氰胺迁移量的测定[J]．包装与食品机械，2011,29（3）：66-68．

[5]GB 9685-2008．食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准[S]．

[6]GB/T 23296．15-2009．食品接触材料 高分子材料 食品模拟物中2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪（三聚氰胺）的测定 高效液相色谱法[S]．

[7]JJF 1059．1-2012．测量不确定度评定与表示[S]．

Uncertainty Evaluation for the Determination of Melamine in Food Simulants of Food Contacted Materials by Hplc

LI Can-ming, BAI Jian-guo

According to JJF 1059.1-2012 “Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement”, the uncertainty of melamine content in food simulants of food contacted materials determined by HPLC was evaluated. The results showed that the melamine content in food simulants water, 10% ethanol, 3% acetic acid and corn oil were (0.502±0.023)mg/L, (0.298±0.023)mg/L, (7.027±0.34)mg/L and (0.637±0.046)mg/ kg, respectively, And the relative standard uncertainty were below 10%.

HPLC; food contacted materials; melamine; uncertainty

G642.0

A

1400 (2017) 02-0039-10

10.19362/j.cnki.cn10-1400/tb.2017.02.002

李灿明（1984-），男，江西莲花人，硕士研究生，奥瑞金包装股分有限公司技术研发中心，食品安全技术主管，邮箱：1358172262@139.com