RNA干扰CXCR4基因对人恶性黑素瘤A375增殖和凋亡的影响*

王正想,冯世军,张广静,张国强 ,刘思源

1．河北省沧州市中心医院皮肤科(沧州061001)，2.河北医科大学第四医院皮肤科(石家庄050010)， 3.河北医科大学第三医院骨与软组织肿瘤科(石家庄050010)

·基础研究·

RNA干扰CXCR4基因对人恶性黑素瘤A375增殖和凋亡的影响*

王正想1,冯世军1,张广静1,张国强2,刘思源3△

1．河北省沧州市中心医院皮肤科(沧州061001)，2.河北医科大学第四医院皮肤科(石家庄050010)， 3.河北医科大学第三医院骨与软组织肿瘤科(石家庄050010)

目的：观察CXCR4基因沉默后人恶性黑素瘤A375细胞增殖及侵袭能力变化。方法：体外培养人恶性黑素瘤A375细胞，分为A、B、C 3组，分别为siRNA组，转染空病毒载体的阴性对照组，细胞不做任何处理的空白对照组。转染后1、3、5、7 d在倒置相差显微镜观察A375细胞分化及形态，MTT比色分析法检测对A375细胞增殖抑制的影响，采用流式细胞分析术，Anexin-ⅴ-PI双染色检测细胞早期凋亡的变化。转染后7d采用RT-PCR检测CXCR4 siRNA表达情况。结果：转染后C组细胞出现不同程度的皱缩、破裂，漂浮细胞增多。转染后1、3、5、7 d，A组OD值低于B、C组(P<0.05)，A组早期凋亡率的变化与B、C组有统计学差异(P<0.05)。RT-PCR半定量分析结果显示，A、B、C组CXCR4基因 mRNA校正值分别为(0.149±0.043)，(0.215±0.030)，(0.221±0.020)，A 组与B、C组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论：CXCR4基因沉默后A375细胞增殖被抑制，早期凋亡增加，CXCR4基因成为恶性黑素瘤治疗的新靶点。

恶性黑色素瘤(Malignant melanoma,MM)是起源于神经嵴的黑素细胞恶性肿瘤，发病率占皮肤恶性肿瘤的第三位[1-2](6.8%～20%)，是皮肤科领域最常引起死亡的恶性肿瘤,其病死率占全部皮肤肿瘤的65%[3]，且发病人数逐渐增多[4]，恶性黑色素瘤的恶性程度高﹑发生转移早,对放/化疗均不敏感 ，目前转移性黑素瘤的预后差，平均生存时间为6～9个月。近年来，认识到MM是一种异质性疾病，其形成与一些信号转导途径的异常相关，其中主要包括CKIT途径、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径、P13K-AKT等途径中的多个基因，MM的分子靶向治疗成为国内外研究的热点。一些研究发现趋化因子受体4(Chemokin receptor 4,CXCR4)在包括黑素瘤在内的多种恶性肿瘤细胞中高表达，参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节,基质细胞衍生因子-1(Stromal cell derived factor，SDF-1)与其特异性受体CXCR4所构成的SDF-1/CXCR4生物学轴在多种肿瘤播散、转移过程中发挥重要作用。本实验研究通过RNAi的方法沉默趋化因子受体4(Chemokin receptor 4,CXCR4)基因，抑制SDF-1/CXCR4信号通路中趋化因子受体4的表达对黑色素瘤侵袭和转移的影响，从而在细胞水平抑制恶性黑色素瘤的生长增殖，为MM治疗提供新的方法。

材料和方法

1 实验细胞与材料 人黑色素瘤细胞株A375由河北医科大学第四医院科研中心提供，胎牛血清购自杭州四季青生物公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)、DMEM(高糖型)培养基均购自美国GIBCO公司，腺病毒载体武汉晶赛生物公司合成，CO2恒温培养箱(TC2323)购自美国Sheldon公司， RT-PCR酶混合物试剂盒(美国Fermentas公司)、二甲基亚枫(DMSO)北京化工厂。

2 细胞培养与分组 A375细胞常规复苏后培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中(含浓度为100 μ/ml青霉素、链霉素，pH7.2～7.4)，置于37℃﹑5% CO2的饱和湿度培养箱中常规传代培养，3次传代稳定后用于实验。将细胞分为A、B、C 组。

3 CXCR4基因合成与转染 培养4～6 h待细胞完全贴壁，小心吸出各孔培养液。各组均加入不含牛血清的培养基100 μl，A、B分别加入DMEM培养基/CXCR4 siRNA病毒载体复合体、DMEM培养基/病毒载体，C 组不做任何处理，感染时间为90 min，每15 min轻轻晃动培养液一次，以混匀。 90 min后移除含病毒的无血清培养液，加入含血清的常规培养液，放入37℃,5% CO2的培养箱中继续培养。细胞培养1、3、5、7d时荧光显微镜下计算转染效率(英光显微镜下细胞个数/光学微镜下细胞个数)，观察细胞分化及形态学变化，消化回收细胞备用。

4 RT-PCR检测三组CXCR4基因mRNA的表达 各组细胞常规培养1 d后，按TRIzol 试剂盒说明书步骤抽提A、B组和C组细胞的总RNA并利用逆转录试剂盒，通过RT-PCR生成cDNA，以cDNA作为模板，采用Real-time PCR检测CXCR4 mRNA，RT-PCR引物设计: 引物由上海捷瑞生物技术服务有限公司负责合成和PAGE纯化，用无菌去离子水稀释，引物序下：上游序列 5-GAACTTCCTATGCAAGGCAGTCC-3，下游序列 5-CCATGATGTGCTGAAACTGGAAC-3。琼脂糖凝胶电泳: 分别取5ulRT-PCR产物、Marker，在1.5%的琼脂糖凝胶中，恒压80V电泳30 min后，用凝胶成像系统观察电泳结果，进行分析。

5 MTT比色法检测沉默CRCX4基因后A375细胞的增殖影响情况 取对数生长期的A375细胞，制备单细胞悬液，进行细胞计数调整至1×104个细胞/200μl，分别接种到5个不同的96孔板中，每组接种6个复孔细胞培养过夜，按上述分组及转染步骤进行转染。转染后盖好盖子，周边贴胶布，在其上标明日期。放入37℃﹑5% CO2的培养。分别在转染后第1、3、5、7天相同时相点时前4 h，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，37℃﹑5% CO2饱和湿度条件下继续培养4 h，4 h后弃上清液，每孔加入DMSO150 μl，避光条件下震荡10～15 min，用全自动酶标仪于波长492nm处测定各孔光吸收值，所有试验重复3次，记录结果。

6 AnnexinⅤ与PI双染，流式检测转染后不同时相的早期凋亡情况 取生长状态良好的瓶装细胞，胰蛋白酶消化，调整细胞密度为1×106/瓶，分到60不同个培养瓶中进行培养。待细胞培养过夜后，随机分为A组、B组、C组，各组组又随机分为1 d，3 d，5 d，7 d组，相当于1 d，3 d，5 d，7 d组每组5个标本，分组后按上述转染步骤进行转染，后继续培养一天，收集1 d组细胞，PBS洗涤后250 μl结合缓冲液重新悬浮细胞，加入5 μlAnnexinⅤ/FITC，室温下孵育避光15 min，加入10 μl的碘化柄锭(PI)溶液，再避光孵育15 min培养瓶，洗去多余抗体和PI,流式细胞仪(FACS)分析，APOI(凋亡细胞数/细胞计数总数)表示细胞凋亡情况，细胞培养3、5、7 d重复以上操作。

7 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行分析，所有实验至少重复3次，数据全部以均数±标准差表示，采用单因素方差分析。P<0.05 表示差异有统计学意义。

结 果

1 倒置相差显微镜观察各组人黑色素瘤细胞A375形态 B、C组细胞生长状态良好，有很强的贴壁能力，细胞膜完整光滑，呈单细胞层片状生长。A组细贴壁能力差，有少数圆形细胞，部分细胞皱缩破裂，折光性差，较多悬浮细胞，贴壁细胞数量较B、C组减少,见图1。

图1 转染后荧光显微镜下细胞形态 (HE染色×400)

2 转染CRCX4基因对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖抑制的影响 转染CRCX4基因后应用MTT法检测细胞生长抑制情况，统计分析结果表明，转染后1、3、5、7 d， A组吸光光度值低于B、C组, A组与C组有显著性差异(P<0.05),而B组与C组之间无显著性差异(P>0.05),见表1。

表1 各组转染后不同时间OD值比较(±s)

注:A组与 C、B组相比,P<0.05

3 转染CRCX4基因后对人恶性黑色素瘤细胞A375早期凋亡的影响 AnnexinⅤ-PI双染色流式细胞仪分析结果显示转染CXCR4基因后1、3、5、7 d， A组凋亡率吸光光度值高于于B、C组, A组与C组、B组有显著性差异(P<0.05),而C组与B组之间无显著性差异(P>0.05)。

4 RT-PCR方法检测各组基因mRNA的表达情况 RT-PCR结果显示：经转染处理后7 d A、B、C组均在300bp处出现电泳条带，但A组CRCX4基因转录水平明显下降。RT-PCR半定量分析结果显示，A组人黑色素瘤A375细胞CRCX4基因 mRNA校正值为(0.149±0.043)，较B组(0.221±0.020)、C组(0.215±0.030)相比差异有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

随着人们对恶性黑色素瘤分子生物学异常的逐步认识，分子靶向治疗成为国内外肿瘤治疗中的热点，开辟了恶性黑色素瘤的新的治疗途径，是该病治疗新的发展方向。

RNA干扰技术是人们研究基因调控的一种新的手段，Fire等在进行线虫基因沉默的研究中将这种双链RNA(ds-RNA)抑制基因表达的现象称为RNA干扰(RNAi)。后来，大量科研人员一直致力于该项技术的改进与完善，现在在基础医学领域，已成为相对比较成熟的调控基因的手段，RNA干扰所采用的载体主要有多聚复合物、纳米颗粒载体、病毒和细菌载体等，病毒载体又可分为逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、和慢病毒[5]等。

目前研究报道[6]中与恶性黑色素瘤分子靶向治疗有关的基因有Raf基因、Ras基因、c-Kit基因、nm23基因[7]等，CXCR4是最常见的趋化因子受体，表达包括卵巢癌，黑素瘤和前列腺癌等肿瘤，但在正常组织中不表达或表达水平很低，越来越多的研究表明，趋化因子受体CXCR4与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节有关，Kim等研究报道，CXCR4在人转移性黑色素瘤高表达，并发现其CXCR4高表达则预后差，然而，CXCR4在黑色素瘤生长和转移过程中具体机制研究尚不多，CXCR-4 通过各种信号通路调控人体的各项机能，而且各种信号通路间存在着紧密的联系，有研究证实CXCR-4可以通过调控 ERK 及PI3K/AKT信号通路影响细胞周期及细胞的增殖 ，因此CXCR4趋化因子可能作为CXCL12的受体通过细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号转导通路发挥促子黑素瘤细胞增殖和凋亡。本实验采用腺病毒相关载体沉默CXCR4基因结果表明A375细胞的增殖受到抑制，流式细胞仪检测细胞的凋亡率增加，沉默CXCR4基因诱导细胞凋亡的机制，目前尚未完全明确。但沉默CXCR4基因后可能通过ERK及MAPK信号转导通路调控细胞增殖、分化，在瘤细胞分化、侵袭和转移中起着重要的作用。沉默CXCR4基因诱导细胞凋亡的机制可能是CXCR4细胞质内，能够使MEK1/2和ERK磷酸化，从而阻断MAPK通路，进而诱导恶性黑色素瘤细胞株A375的早期凋亡。

[1] 饶国洲，石建峰，王欣欣.Survivin 和 Bcl-2基因靶向 siRNA 对舌癌 Tca-8113细胞生长抑制及诱导凋亡作用的影响[J].陕西医学杂志,2015,44(2):140-143.

[2] 王玲艳,晋红中.2014年皮肤恶性肿瘤发病机制研究进展[J].中华皮肤科杂志,2015,(48)11:822-825.

[3] Dzwierzynski W.Managing malignant melanoma[J].Plast Reeonstr Surg,2013,132(3):446e-4460e．

[4] Nikolaou V，Stratigos AJ．Emerging trends in the epidemiology of melanoma[J]．Br J Dermatol，2014，170(1):11-19．

[5] 王 欢,马志强,杨 峰.用于肿瘤治疗的小分子干扰RNA非病毒载体研究进展[J].药学实践杂志,2015,(6):498-501.

[6] 高凤琴,张丽莉. RNA干扰的研究进展[J].陕西医学杂志,2008,37(6):738-739.

[7] 王希胜. 山仙颗粒对小鼠黑色素瘤肺转移中nm23/NDPK水平的影响[J]. 陕西中医,2006,27(2):244-245.

(收稿：2016-05-15)

Effection of A375 cells in proliferation and apoptosis after silencing CXCR4 gene

Wang Zhengxiang ,Feng Shijun ,Zhang Guangjing,et al.

Institute of Dermatology,The Center Hospital of Cangzhou(Cangzhou 061001)

Objective：To explore the proliferation and apoptosis of A375 cells after silencing CXCR4 gene. Methods:Human malignant melanoma A375 cells were cultivated and divided into groups A,B and C：siRNA group with adenovirus carrying RNA interference,negative group with vacant adenovirous vector,and control group without any infection.The differentiation and morphology of cells were observed by inverted microscope. 1, 3, 5, 7days after transfection,cells proliferation ability was determined by MTT,and apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI.The expressions of CXCR4 mRNA was detected by RT-PCR 7 days after transfection. Results:The cells proliferation ability of group A at 1, 3, 5 and 7days after transfection was lower than those in groups B and C(P<0.005).The expression of CXCR4 siRNA decreased in the A group than groups B and C .CXCR4 gene silenced by siRNA could inhibit the growth of A375 cell proliferation(P<0.05)and induce early cells apoptosis(P<0.05).Conclusion:The cells proliferation ability of A375 is inhibited and apoptosis is induced after silencing CXCR4 gene.

Melanoma Adenoviruses, Human @A375cell @CXCR4 Apoptosis

*国家自然科学基金资助项目(30440086)

黑色素瘤 腺病毒, 人 @A375细胞 @CXCR4 细胞凋亡

R739.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.04.001

△通讯作者