黑木耳泡菜发酵液配方优化研究

张羲，陈安特，吴秋昊，张文娟，潘亮，贾利蓉＊

（1.四川大学轻纺与食品学院，成都 610065；2.四川江中源食品有限公司，四川德阳 618000）

黑木耳泡菜发酵液配方优化研究

张羲1，陈安特1，吴秋昊1，张文娟1，潘亮2，贾利蓉1＊

（1.四川大学轻纺与食品学院，成都 610065；2.四川江中源食品有限公司，四川德阳 618000）

以黑木耳为主要原料，人工接种乳酸菌进行发酵。采用单因素试验研究食盐、蔗糖及乳酸添加量对发酵液pH、总酸及黑木耳感官品质的影响，在此基础上设计响应面试验优化发酵液配方。试验结果表明：食盐添加量为3.35%、蔗糖添加量为4.11%、乳酸添加量为0.112%的条件下，黑木耳泡制6天后感官品质最佳。验证试验表明：最优工艺参数发酵后总酸的平均值为（0.2903±0.004）g／dL，pH为（3.21±0.015），其他理化指标和微生物指标均合格，为黑木耳泡菜开发及产业化生产奠定了基础。

黑木耳；乳酸；响应面法

黑木耳（Auricularia auricula）又名木菌、树鸡，隶属于真菌门，担子菌纲，木耳目，木耳科［1］。其营养丰富，具有重要的食药用价值，有研究表明：黑木耳具有降血糖、降血脂、抗衰老、抗辐射、提高机体免疫力等作用［2－4］。国际上栽培食用菌的国家很多，但是栽培黑木耳的国家却很少，只有菲律宾、泰国等少数国家［5］。我国是黑木耳的主产国，所以在国内开发和利用黑木耳资源方面具有得天独厚的优势［6］。目前黑木耳主要用于日常烹饪食用，其深加工利用尚处于初级阶段。关于黑木耳的研究，主要集中在粗加工、有效成分提取及药理作用研究领域［7］。谢晨阳等［8］以白菜为原料，在泡菜制作过程中以黑木耳粉作为辅料，优化自然发酵黑木耳泡菜制作的工艺条件，尚无采用乳酸菌接种发酵制作黑木耳泡菜的相关研究。

泡椒黑木耳在四川省是一道家喻户晓的菜肴，其制作方法主要是泡辣椒及其汁水和黑木耳凉拌而成，黑木耳本身没有经过发酵。笔者在研究乳酸菌接种发酵黑木耳中发现发酵过程中乳酸积累缓慢，接种发酵2天后，pH降至4.3左右，增加了大肠杆菌等杂菌生长的风险［9，10］。对黑木耳可发酵性糖组成分析结果表明：黑木耳只含有少量葡萄糖（＜0.4g／100g），远低于萝卜、白菜等蔬菜原料，并且未检测到蔗糖、果糖。因此，开发黑木耳泡菜必须在泡菜水中添加可发酵性糖，使乳酸发酵迅速启动以保证发酵体系的安全性。故本试验以黑木耳为原料，采用人工接种进行发酵，以食盐、蔗糖和乳酸添加量为试验因素，利用响应面法研究黑木耳发酵液的最佳配方，以期为黑木耳泡菜的开发及产业化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原辅材料

黑木耳：四川省青川县川珍实业有限公司生产。

1.1.2 发酵剂

植物乳杆菌（L.plantarum）（菌株编号1.926），肠膜明串珠菌（L.mesenteroides）（菌株编号1.656），均购自四川省微生物资源平台菌种保藏中心。

1.1.3 试剂

氢氧化钠、邻苯二氢酸钾、酚酞、MRS肉汤培养基、琼脂培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂培养基：分析纯，购于成都市科龙化工试剂厂；乳酸：食品级，购于河南金丹乳酸科技有限公司；氯化钙：食品级，购于河南喜莱客化工产品有限公司。

1.1.4 主要设备

LDZX－50FB型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；隔水式恒温培养箱 上海森信实验仪器有限公司；PHS－3C型精密数显pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；LaboGene Scanspeed1736R高速冷冻离心机 丹麦LaboGene公司；UV－1240型紫外可见光分光光度计 北京华运安特科技有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 黑木耳泡菜制作方法

黑木耳在50℃泡发30min，洗净，切去主根及剔除病虫害部分后备用。以水的质量为基准，根据实验设计添加0.3%CaCl2、不同质量分数的食盐、蔗糖和乳酸配制泡菜水，高温灭菌（121℃，15min）后备用。将保藏于试管中的植物乳杆菌及肠膜明串珠菌，经MRS肉汤培养基分别于37℃和28℃下增菌培养30h后，用离心机在4℃，4000r／min进行无菌离心5min，将离心得到的菌泥用生理盐水按照上述步骤洗涤2～3次后，对所得到的菌泥适当稀释并等体积混合，按2%接种量加入到发酵盐水中，并使接种后的发酵盐水中乳酸菌活菌数达到107～108cfu／mL。称取黑木耳400g、泡菜水1250g，装入泡菜坛，置于设定温度为25℃的恒温培养箱中发酵。

1.2.2 pH及总酸测定方法

取20mL泡菜水，在4℃，14000r／min下离心15min，取上清液用pH计测定pH值。总酸度采用电位滴定法测定［11］，均重复测试3次，取平均值。

1.2.3 感官评定方法

由10名食品专业人士组成小组，从色泽及形态、香气、质地及滋味方面对黑木耳泡菜进行感官评价，参照陈功的评分标准进行评分［12］。

1.2.4 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，选取食盐、蔗糖及乳酸添加量为自变量因素，恒温发酵6天后，以总酸和感官评定为响应值，对黑木耳泡菜水配方进行优化试验研究。

1.2.5 黑木耳泡菜理化指标和微生物指标检测

按照四川泡菜标准［13］判断用最优参数生产黑木耳泡菜的理化指标和微生物指标是否合格。其中，亚硝酸盐测定按照GB／T 5009.33；总砷测定按照GB／T 5009.11；铅测定按照GB／T 5009.12；大肠菌群测定按照GB／T 4789.3；致病菌测定按照GB／T 4789.4，GB／T 4789.5和GB／T 4789.10。

1.2.6 试验数据统计分析

试验数据采用Origin 8.0进行作图分析；采用Design Expert 8.0.6软件对中心组合试验设计的试验数据进行相关性和差异显著性统计分析。

2 结果与分析

2.1 食盐添加量对黑木耳泡菜发酵过程的影响

图1 食盐添加量对pH的影响Fig.1 Effect of different concentration of salt on pH

由图1可知，各实验组发酵过程中pH值的变化趋势无明显差异：0～4天时，发酵液的pH值显著降低（P＜0.05）；6天后各实验组的pH无明显变化；第10天时，pH值均在3.3以下。

图2 食盐添加量对总酸的影响Fig.2 Effect of different concentration of salt on total acid

由图2可知，发酵液中食盐添加量不同，导致发酵过程中总酸含量及产酸速率明显不同；在发酵中，食盐添加量越大，盐水pH值增大，总酸含量减少，产酸速率也越慢，这是因为随着含盐量增加，渗透压越大，乳酸菌等微生物的生长受到抑制。张艳等［14］的研究也表明食盐添加量为8%时产酸较少，高浓度食盐水不利于乳酸的积累。

图3 食盐添加量对感官评分的影响Fig.3 Effect of different concentration of salt on sensory score

由图3可知，当食盐添加量小于8%时，黑木耳泡菜的感官评分较高。

2.2 蔗糖添加量对黑木耳发酵的影响

图4 蔗糖添加量对pH的影响Fig.4 Effect of different concentration of sugar on pH

图5 蔗糖添加量对总酸的影响Fig.5 Effect of different concentration of sugar on total acid

由图4和图5可知，发酵过程中，随着蔗糖添加量增大，发酵液pH值减小，总酸含量增高，且产酸速率越大，说明蔗糖在发酵初期对促进乳酸发酵影响显著；第8～10天，pH值降低至3.2左右；第10天，各实验组总酸含量接近，差异性不显著（P＞0.05）。分析认为乳酸积累抑制了微生物的发酵［15］。

图6 蔗糖添加量对感官评分的影响Fig.6 Effect of different concentration of sugar on sensory score

由图6可知，蔗糖添加量对黑木耳泡菜的感官评分有较大影响，当蔗糖质量分数大于5%时，感官评分下降明显，这是因为过多的蔗糖没有被微生物充分利用，导致泡菜滋味偏甜。

2.3 乳酸添加量对黑木耳发酵的影响

图7 乳酸添加量对pH的影响Fig.7 Effect of different concentration of lactic acid on pH

图8 乳酸添加量对总酸的影响Fig.8 Effect of different concentration of lactic acid on total acid

由图7和图8可知，乳酸处理组与空白组发酵起始时，pH值与总酸含量存在显著差异（P＜0.05），随着乳酸添加量的增大，发酵过程中pH值下降，总酸含量增加，且趋势无明显差异；发酵2天后，添加乳酸进行发酵的实验组，其pH均下降至3.5以下，而空白组降至4.3左右，增加了大肠杆菌等杂菌生长的风险；乳酸添加量为0.10%的实验组总酸含量上升较快，这与该浓度发酵液的pH值变化相一致；乳酸浓度大于0.15%的总酸变化趋势较弱，说明该浓度对乳酸菌有一定的抑制作用。王晓云、黄琴等［16，17］研究也表明发酵过程中，随着乳酸添加量的增加，对发酵前期产酸的抑制作用逐渐增强，pH值和总酸含量变化趋势都较弱。

图9 乳酸添加量对感官评分的影响Fig.9 Effect of different concentration of lactic acid on sensory score

由图9可知，乳酸浓度小于0.15%的3组感官评分明显优于对照组。添加一定量的外源乳酸可以改善产品品质，对发酵时风味形成有积极作用。

2.4 响应面试验优化黑木耳泡菜发酵液配方

采用Design Expert 8.0对食盐、蔗糖和乳酸添加量进行优化，因素水平和试验结果见表1和表2。

表1 响应面试验因素和水平编码表Table 1 Factors and levels of response surface experiment %

表2 Box－Behnken试验设计方案及响应值Table 2 Box－Behnken design and response values

经过回归拟合得到以总酸和感官评分为响应值的回归方程，见表3。

表3 回归分析表Table 3 Regression analysis table

R2和RAdj2表明模型具有较高的准确度和精确度，失拟性检验的结果表明：预测值与实测值拟合较好，P检验结果表明：模型极其显著（P＜0.01）。

表4 总酸方差分析表Table 4 Variance analysis table of total acid

由表4可知，一次项C，二次项B2，C2对总酸的影响极其显著（P＜0.01），B和A2的影响显著（P＜0.05），其余项均不显著（P＞0.05）。由方差中F值的大小可得三因素对总酸的影响大小顺序为：乳酸添加量＞蔗糖添加量＞食盐添加量。

表5 感官评分方差分析表Table 5 Sensory evaluation variance analysis table

由表5可知，一次项A，B，C，二次项A2，B2，C2对感官评分的影响极其显著（P＜0.01），其余项均不显著（P＞0.05）。由方差中F值的大小可得三因素对感官评分的影响大小顺序为：乳酸添加量＞食盐添加量＞蔗糖添加量。

2.5 响应曲面分析

图10 总酸的响应面图Fig.10 Response surface of total acid

图11 感官评分的响应面图Fig.11 Response surface of sensory score

由图10和图11可知，3个因素对总酸和感官评分的影响都较大，但乳酸添加量的影响最大，这可能是因为添加外源乳酸对泡菜的总酸及滋味的形成有较大影响，适量的乳酸使黑木耳酸味柔和、清脆爽口，对发酵产品的风味品质有改善的作用。

2.6 验证实验结果

利用Design Expert对回归方程进行优化得到：在食盐添加量3.35%、蔗糖添加量4.11%、乳酸添加量0.112%的条件下，感官评定的分值最大，为87.9。考虑到实际操作的可行性，将参数修正为食盐添加量3.35%、蔗糖添加量4.11%、乳酸添加量0.11%，以上最优参数所制得的泡菜酸味柔和、清脆爽口、咸淡适中，有黑木耳独有的发酵香味。

表6 黑木耳泡菜理化指标和微生物指标Table 6 Physicochemical and microbial indicators

由表6可知，其理化指标和微生物指标也均符合四川泡菜地方标准。因此，利用最优参数生产出来的黑木耳泡菜口感品质俱佳。

3 结论

单因素试验表明：高浓度食盐水不利于乳酸积累；蔗糖添加量越大，产酸速率越快。添加一定量的外源乳酸可降低起始pH值，提高总酸含量以及有效抑制发酵过程中有害微生物的污染，对黑木耳的发酵风味品质有改善的作用。

经响应面优化及验证实验得出黑木耳泡菜发酵液的最佳参数为：食盐添加量3.35%、蔗糖添加量4.11%、乳酸添加量0.11%，此条件下所制得的黑木耳泡菜感官评分最佳，为其开发及产业化生产奠定了基础。

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Optimization on Formula of Fermentation Broth from Auricularia auricular Pickle by Response Surface Method

ZHANG Xi1，CHEN An－te1，WU Qiu－hao1，ZHANG Wen－juan1，PAN Liang2，JIA Li－rong1＊
（1.College of Light Industry，Textile and Food Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China；2.Sichuan Jiangzhongyuan Food Co.，Ltd.，Deyang 618000，China）

Take Auricularia auricular as the raw material；inoculate lactobacillus for fermenting Auricularia auricular.Single factor experiments are carried out to investigate the effects of salt content，sugar content and lactic acid content on pH，total acid content of fermentation broth and sensory quality of Auricularia auricular.On the basis，response surface test is designed to optimize the formula of fermentation broth.The experimental results show that when salt additive amount is 3.35%，sugar additive amount is 4.11%and lactic acid additive amount is 0.112%，the sensory quality of Auricularia auricularis the best after being fermented for 6days.The verification test shows that after being fermented with the optimal process parameters，the mean value of total acid is（0.2903±0.004）g／dL and pH is（3.21±0.015），the other physicochemical and microbial indicators are all qualified，which has laid a foundation for the development and industrialization of Auricularia auricular pickles.

Auricularia auricular；lactic acid；response surface method

TS255.54

A

10.3969／j.issn.1000－9973.2017.04.011

1000－9973（2017）04－0047－06

2016－10－15 ＊通讯作者

张羲（1990－），女，山东德州人，硕士，研究方向：食品科学；贾利蓉（1972－），女，四川成都人，副教授，硕士生导师，研究方向：农产品贮藏与加工。