人参三七配伍对脑缺血再灌注损伤小鼠血脑屏障通透性及脑组织炎症反应的影响

张 楠 黄 鑫 戴雨霖 越 皓 于 洋 刘淑莹

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

人参三七配伍对脑缺血再灌注损伤小鼠血脑屏障通透性及脑组织炎症反应的影响

张 楠 黄 鑫 戴雨霖 越 皓 于 洋 刘淑莹

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

目的 观察人参和三七配伍提取物对脑缺血再灌注损伤(CIRI)小鼠血脑屏障(BBB)通透性及脑组织炎症反应的影响。方法 通过结扎小鼠双侧颈总动脉制备CIRI模型。用红四氮唑(TTC)染色测定CIRI小鼠脑梗死比和脑组织含水量，通过测定渗出脑血管外的伊文思蓝含量，分析人参三七配伍对CIRI小鼠BBB 通透性的影响；光学显微镜下观察CIRI小鼠脑组织病理形态，采用酶联免疫法(ELISA)检测小鼠脑组织中白细胞介素(IL)-1β、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达水平。结果 人参和三七配伍的提取物可明显减少CIRI小鼠脑梗死比及脑组织含水量、降低小鼠脑组织中伊文思蓝含量、改善BBB通透性和脑组织病理状态、降低脑组织IL-1β和TNF-α 的表达水平、增加脑组织 IL-10的表达水平。结论 人参和三七配伍提取物对CIRI小鼠具有显著保护作用，其机制与降低CIRI小鼠BBB通透性及脑组织炎症反应有关。

人参；三七；血脑屏障；脑缺血再灌注损伤；炎症

脑缺血再灌注损伤(CIRI)的发生是一个十分复杂的病理生理过程，诸多种生物活性因子和多条细胞内信号转导途径参与其中〔1,2〕。研究表明，脑缺血再灌注早期的血脑屏障(BBB)损伤过程与炎症反应相关，其损伤导致血液系统成分渗入脑组织内, 引起血管源性脑水肿〔3〕；脑缺血再灌注发生后，中性粒细胞和胶质细胞等炎症细胞被激活，白细胞介素(IL)-1β、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α等细胞因子参与其炎症反应〔4,5〕。占颖等〔6〕研究结果显示，益气活血通过降低血浆血管性血友病因子(vWF)和血栓调节蛋白(TM)抗CIRI。近年来，许多天然药物被用于CIRI的研究，如人参、三七、黄芪等〔7～10〕。在中医临床用药中，人参性微温，多作为扶正固表的“气分药”，三七性温，多作为散瘀止血和消肿定痛的“血分药”〔11〕。本研究以益气活血为配伍基本原则，采用结扎双侧颈总动脉制作CIRI小鼠模型，探讨人参和三七配伍提取物对CIRI小鼠的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级健康雄性昆明小鼠240只，体重25～30 g，购自吉林大学动物中心提供，合格证号：SCXK-(吉)2008-0005。

1.2 人参、三七 人参和三七饮片均购于吉林省长春市同仁堂大药房，分别为五加科植物人参Panax ginsengC.A.Mey的干燥根茎和五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen的干燥根茎的炮制后饮片。

1.3 试剂和主要仪器 依达拉奉注射液购自南京先声东元制药有限公司，生产批号:20150508；水合氯醛购自天津市大茂化学试剂厂，生产批号：20151106；红四氮唑(TTC)购自上海瑞永生物科技有限公司,生产批号:S0022；伊文思蓝(EB)购自国药集团化学试剂有限公司,生产批号:20130110；白细胞介素(IL)-1β、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，生产批号分别为20151002、20150908、20151105。电子分析天平购自赛多利斯科学仪器有限公司；M200PRO型酶标仪为帝肯公司产品；1-14小型台式离心机购自德国Sigma公司；IDA-2000数字医学图像分析系统为北京空海科技发展有限公司提供。

1.4 人参、三七及人参和三七配伍组方提取物的制备 分别称取人参饮片15 g(人参单味组)、三七饮片15 g(三七单味组)、人参饮片20 g和三七饮片10 g(配伍组)于圆底烧瓶中，分别加入饮片10倍量的70%乙醇浸泡30 min后，将圆底烧瓶置水浴锅上加热回流提取90 min，即刻用循环水式真空泵和布氏漏斗进行减压抽滤；同法对药渣再次煎煮60 min，合并2次滤液；用旋转蒸发仪(上海爱朗仪器，型号N1100)对滤液进行减压回收乙醇后,置真空冷冻干燥机(日本东京理化EYELA公司，型号FDU-1100)中进行冷冻干燥48 h，得到人参、三七及人参和三七配伍提取冻干物。

1.5 动物分组和给药 随机分为6组：模型组、人参单味组、三七单味组、配伍组、阳性药(依达拉奉注射液)组及假手术组，每组40只；在造模前14 d，人参、三七单味组及配伍组分别持续灌胃，给药量分别为127、81.9、160 mg/kg，灌胃体积均0.1 ml/10 g，1次/d；于造模前1 h再各给药1次；模型组和假手术组同期灌胃等体积的生理盐水。

1.6 CIRI小鼠模型的制备 于小鼠腹腔注入5%水合氯醛(0.1 ml/10 g)进行麻醉，麻醉后，于小鼠颈正中切口，分离小鼠双侧颈总动脉和迷走神经，用小动脉夹夹闭小鼠双侧颈总动脉20 min后，打开动脉夹，再灌注24 h，断头处死每组小鼠。假手术组只分离双侧颈总动脉和迷走神经，不夹闭。

1.7 小鼠脑梗死比和脑含水量的测定 再灌注24 h后，各组取8只小鼠断头处死，去掉小脑和脑干，电子分析天平称量大脑重量(湿重)，分别于脑前级、视交叉中点、视交叉、漏斗部切2 mm厚冠状脑切片；将各脑切片置0.5% TTC溶液中，于37℃孵育染色10 min后，分离各脑切片白色区域(梗死区)和红色区域(正常区)，称小鼠脑切片白色区域质量，按下面公式计算小鼠脑梗死比；将各脑切片置100℃烘箱内烘烤24 h后，取出称干燥后脑切片总质量，按下面公式计算小鼠脑含水量〔12〕。小鼠脑梗死比(%)= 脑切片梗死区质量/脑切片总质量×100%。小鼠脑含水量(%)=(大脑湿重-脑切片干重)/大脑湿重×100%。

1.8 小鼠脑组织病理形态的观察 再灌注24 h后，各组取6只小鼠断头处死，去除小脑和脑干后，置10%中性甲醛固定液中充分固定24 h，常规病理脱水、包埋、切片、HE染色后，光学显微镜下观察小鼠脑组织形态变化。

1.9 小鼠血脑屏障(BBB)通透性的测定 再灌注24 h后，经小鼠右侧股静脉注入2% EB生理盐水溶液(4 ml/kg)进行麻醉，麻醉后，打开胸腔暴露心脏，剪开右心耳，经左心室灌注生理盐水清除血管内血液和伊文思蓝至右心耳流出液体清亮为止；断头取脑，用电子分析天平称量脑组织湿重(g)，将脑组织置甲酰胺水溶液中充分研磨(每100 mg脑组织加入1 ml甲酰胺)后，置60℃水浴中；24 h后取出，5 000 r/min离心10 min；取上清液200 μl，加入96孔酶标板中，在酶标仪上测定630 nm处A630 值。脑组织EB含量(μg/g)=待测样品EB含量(μg/ml)×甲酰胺量( ml) /脑组织湿重(g) ，待测样品EB含量通过标准曲线求得。

1.10 小鼠脑组织中IL-1β、TNF-α、IL-10表达水平的检测 分别于小鼠脑缺血再灌注0、6、24 h后，断头开颅取脑，去掉小脑及脑干；用4℃生理盐水将大脑部分制成10%匀浆液，3 000 r/min离心15 min，取上清液，ELISA法检测小鼠脑组织中IL-1β、TNF-α、IL-10的表达水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.11 统计学分析 采用SPSS16.0软件单因素方差分析及LSD检验。

2 结 果

2.1 人参和三七配伍对CIRI小鼠脑梗死比例和脑含水量的影响 与假手术组比较，模型组脑梗死比、脑含水量明显升高(均P<0.01)；与模型组比较，人参单味组可减轻小鼠脑含水量(P<0.05)，配伍组同时显著减轻脑含水量和脑梗死比(均P<0.01)；与人参单味组、三七单味组比较，配伍组可显著降低脑组织脑梗死比(均P<0.01)；与三七单味组比较，配伍组能显著降低脑组织含水量P<0.01)；与人参单味组比较，配伍组可有效降低脑组织含水量(P<0.05)。见表1。

2.2 人参和三七配伍对CIRI小鼠脑组织病理形态的影响 光镜显微镜观察结果显示：假手术组组织结构致密,细胞胞浆丰富,核膜清楚；模型组组织结构疏松,呈筛网状,形态模糊,炎症细胞增多；依达拉奉组组织结构致密,细胞胞浆丰富,核膜清楚，炎症细胞较少。与假手术组相比，配伍组组织结构致密,细胞质丰富,核膜清楚，炎症细胞较少；人参、三七单味组组织结构也较配伍组疏松,呈筛网状,形态模糊,且炎症细胞增多。见图1。

2.3 人参和三七配伍对CIRI小鼠BBB通透性的影响 与假手术组比较，模型组小鼠脑组织EB含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，人参单味组可有效降低小鼠脑组织EB含量(P<0.05)，配伍组能显著降低小鼠脑组织EB含量(P<0.01)；与三七单味组比较，配伍组能显著降低小鼠EB脑含量(P<0.01)；与人参单味组比较，配伍组可有效降低小鼠脑组织EB含量(P<0.05)。见表1。

组别脑梗死比(%)脑含水量(%)脑组织EB含量(μg/g)假手术组0.00±0.001)77.56±0.171)4.58±0.831)模型组24.77±2.511)85.39±1.528.51±1.36依达拉奉组14.35±1.901)78.62±3.521)4.93±0.951)人参单味组21.62±2.53)80.65±0.992)4)6.07±1.122)4)三七单味组22.65±1.563)82.02±1.363)7.65±0.893)配伍组13.25±2.881)79.05±1.421)5.12±0.891)

与模型组比较：1)P<0.01,2)P<0.05;与配伍组比较：3)P<0.01,4)P<0.05；下表同

图1 各组小鼠脑组织病理形态变化(HE，×400)

2.4 人参和三七配伍对CIRI小鼠脑组织中促炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β)表达水平的影响 与假手术组比较，模型组脑缺血再灌注0 h和6 h后，脑组织中TNF-α和IL-1β的表达水平显著增加(P<0.01)；在脑缺血再灌注24 h后，细胞因子TNF-α和IL-1β的表达水平开始下降。与模型组比较，在脑缺血再灌注0 h和6 h后，配伍组和依达拉奉组IL-1β和TNF-α的表达水平显著降低(均P<0.01)；与人参、三七单味组比较，在脑缺血再灌注0 h和6 h后，配伍组可明显降低IL-1β表达水平(P<0.05，P<0.01)；与人参单味组比较，在脑缺血再灌注0 h和6 h后，配伍组可显著降低TNF-α表达水平(均P<0.01)；与三七单味组比较，在脑缺血再灌注0 h、6 h后，配伍组可明显降低TNF-α表达水平(P<0.01，P<0.05)。见表2。

2.5 人参和三七配伍对脑组织中抗炎症细胞因子(IL-10)含量的影响 与假手术组比较，模型组脑缺血再灌注的0、6、24 h后，脑组织中IL-10含量显著降低(P<0.01)。与模型组比较，在脑缺血再灌注6、24 h后，配伍组可以显著增加IL-10含量(P<0.05，P<0.01)；与人参、三七单味组比较，在脑缺血再灌注24 h后，配伍组可显著增加IL-10含量(P<0.01)。见表2。

组别IL-1β0h6h24hTNF-α0h6h24hIL-100h6h24h假手术组12.77±1.231)12.08±1.121)12.12±1.334.83±0.731)4.89±0.871)4.93±0.7910.25±0.931)10.31±1.021)10.13±0.951)模型组18.83±1.0526.52±0.9813.41±1.6913.87±1.0512.95±0.985.89±1.697.69±1.057.73±0.557.82±0.69人参单味组16.88±0.984)23.27±0.993)12.69±0.9811.55±0.953)11.86±0.873)5.69±0.898.51±0.988.74±0.789.08±1.083)三七单味组17.85±0.584)25.39±1.533)13.56±0.8810.49±0.582)3)9.08±1.461)4)5.28±0.829.32±0.799.85±0.869.33±0.813)配伍组14.13±1.851)17.61±1.471)12.58±1.046.91±0.841)7.25±1.071)5.26±1.149.52±0.8110.99±0.642)13.86±1.601)依达拉奉组13.98±0.871)16.59±2.091)12.49±0.996.23±0.971)6.96±1.291)5.39±0.9310.84±0.822)13.58±0.831)15.67±1.361)

3 讨 论

CIRI的发生机制及防治一直受到国内外越来越多学者的关注〔2,13～15〕，许多用于CIRI的临床治疗药物被研制出来或处于临床前研发阶段〔16～20〕。但因CIRI的发生机制十分复杂，能够达到预期治疗效果的药物并不多。研究表明，脑组织中炎症细胞因子参与的炎症反应是CIRI发生的重要原因之一〔21〕；脑缺血时血液中的炎症细胞向脑组织内浸润，激活脑组织中的胶质细胞，脑组织中促炎症细胞因子增多，炎症反应失控，从而加重CIRI〔22〕。近年来，许多天然药物被用于治疗CIRI的研究〔6～11〕。刘俊伟等〔7〕研究结果显示，人参皂苷Rb1对大鼠CIRI的保护作用与其抑制炎症因子IL-1β蛋白表达有关；王昊等〔23～25〕研究结果显示，人参水煎液能够使免疫低下小鼠血清中IL-4、干扰素(IFN)-γ表达水平恢复到正常水平，可提高正常小鼠及免疫抑制小鼠体内淋巴细胞、NK细胞活性及血清中IL-2表达水平。唐映红等〔26〕研究结果显示，三七总皂苷具有改善BBB通透性、 清除自由基、抗炎、抗氧化等作用；王金翠等〔9〕研究结果显示，血三七水煎液对大鼠局灶性CIRI有保护作用，其机制可能与其减少自由基的产生，抑制 NO 生成有关。

本研究结果显示，与人参和三七单味用药效果比较，人参和三七配伍的提取物通过降低CIRI小鼠BBB通透性及脑组织炎症反应，可明显减少CIRI小鼠脑梗死面积及脑组织含水量、降低该小鼠脑组织中EB含量、改善CIRI小鼠BBB通透性、降低CIRI小鼠脑组织中促炎症因子 IL-1β 和 TNF-α 的表达水平、提高CIRI小鼠脑组织中抗炎症因子 IL-10的表达水平，对CIRI后小鼠具有显著的保护作用。

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〔2016-12-09修回〕

(编辑 曹梦园)

国家自然科学基金面上项目(21475012)；农业部公益性行业(农业)科研专项经费项目(20130311106)

刘淑莹(1943-)，女，教授，博士，博士生导师，主要从事天然产物分析研究。

张 楠(1983-)，女，讲师，硕士，主要从事中药有效成分研究。

R28

A

1005-9202(2017)07-1580-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.007