蛋白磷酸酶2A Cα在昆虫杆状病毒中的表达及活性

渠 静 郑 媛 任晓曦 郑 焱 杨 慧 张建亮

(首都医科大学基础医学院神经生物学系 北京脑重大疾病研究院教育部神经变性病重点实验室，北京 100069)

蛋白磷酸酶2A Cα在昆虫杆状病毒中的表达及活性

渠 静 郑 媛 任晓曦 郑 焱 杨 慧 张建亮

(首都医科大学基础医学院神经生物学系 北京脑重大疾病研究院教育部神经变性病重点实验室，北京 100069)

目的 利用昆虫杆状病毒系统表达蛋白磷酸酶(PP)2A Cα亚基并进行活性分析。方法 先将PP2A Cα构建进入昆虫杆状病毒表达载体，然后将其转染到昆虫细胞Sf9中并进行蛋白表达，最后检测PP2A Cα的功能。结果 Western印迹结果表明PP2A Cα蛋白已经在昆虫细胞成功表达;PP2A活性检测和GST pull-down实验结果表明PP2A Cα蛋白既有生物学功能，又有结构学功能。结论 昆虫杆状病毒载体系统可以成功表达有活性的PP2A Cα蛋白。

昆虫杆状病毒；蛋白磷酸酶2A

蛋白磷酸酶(PP)2A参与DNA复制、RNA剪接、基因表达、细胞代谢、分化及凋亡等活动过程，并且与老年疾病的发生发展有着密切联系〔1，2〕。在帕金森病(PD)中，α-突触核蛋白(α-Syn)可以使PP2A活性上调，从而使酪氨酸羟化酶(TH)去磷酸化，抑制TH活性，进而抑制多巴胺的生物合成〔3〕。在阿尔茨海默病(AD)中，PP2A活性降低，抑制tau去磷酸化，使tau蛋白过度磷酸化，进而形成神经元纤维缠结〔4〕；PP2A活性降低也会增加β淀粉样蛋白(Aβ)生成〔5〕。因此，PP2A已成为老年疾病研究的焦点之一。PP2A由结构亚基-A和催化亚基-C形成核心酶，然后再和调节亚基-B组成全酶；其中C亚基有α和β两种异构体，它在PP2A活性的调节中起着极其重要的作用。但是目前，PP2A确切的调节机制还不十分清楚。昆虫杆状病毒表达系统是近年来备受青睐的真核表达系统，利用杆状病毒作为外源基因的载体，通过感染昆虫细胞来表达外源蛋白，具有安全性好、蛋白表达量高、可以同时表达多个基因等优点〔6〕。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统，在昆虫细胞内表达PP2A Cα亚基，从而得到PP2A Cα蛋白，进一步实验证明其结构完整、活性稳定。

1 材料和方法

1.1 材料 昆虫细胞Sf9，DH10Bac大肠杆菌细胞，pFastBacTM质粒购自Invitrogen公司；Sf-900 Ⅱ无血清培养基购自美国Gibco公司；聚醚酰亚胺购自美国Sigma公司；PP2A活性比色法定量检测试剂盒购自Genmed公司；His抗体购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 昆虫细胞Sf9采用SF-900Ⅱ无血清的培养基，置于27℃的摇床上进行悬浮培养。Bacmid用聚醚酰亚胺(PEI)转染到Sf9细胞中。

1.2.2 重组质粒的构建 用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ将PP2A Cα基因从质粒pcDNA3.1中切出，亚克隆到质粒pFastBacTM的相应酶切位点，得到质粒pFastBac-PP2A Cα(图1)，经过酶切鉴定以及测序进行确认。

1.2.3 重组昆虫杆状病毒的构建 将构建好的pFastBac-PP2A Cα转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素和X-gal的固体LB培养基上培养，进行蓝白斑筛选。将白色的单菌斑进行培养，抽提得到重组bacmid，然后通过PCR进行鉴定。用脂质介导法将bacmid转染到昆虫细胞Sf9中，72 h后得到培养基上清，即为第1代重组昆虫杆状病毒。加入第1代重组昆虫杆状病毒感染正常的Sf9细胞，扩增依次得到第2代昆虫杆状病毒。

A：pFastBac载体以及PP2A Cα插入片段的示意图;B：pFastBac-PP2A Cα的酶切鉴定图；1:DNA ladder；2和3:pFastBac-PP2A Cα的酶切图(pFastBac:4 800 bp;PP2A Cα:900 bp)图1 pFastBac-PP2A Cα的质粒构建以及酶切鉴定图

1.2.4 重组蛋白的表达与检测 取第2代重组昆虫杆状病毒加入到正常的Sf9细胞中进行蛋白表达。3 d后收取细胞,离心得到细胞沉淀，提取蛋白质。提取的蛋白质用于SDS-PAGE和Western印迹检测。按照每个孔道2 μg 蛋白上样，经过15%的SDS-PAGE分离蛋白质，半干法将蛋白质转至PVDF膜。PVDF膜用5%(体积分数)的脱脂牛奶室温封闭1 h，与鼠抗人单克隆抗His抗体(1∶2 000)于室温反应2 h，然后与抗鼠荧光二抗(1∶10 000)于室温反应1 h，用Odyssey Infrared成像系统检测。

1.2.5 PP2A活性检测 根据文献〔7,8〕，参照Genmed试剂盒提供的使用说明书检测PP2A活性。

1.2.6 GST pull-down实验 将含有GST标签的α-Syn蛋白与GST珠子在4℃结合1 h，然后加入提取的PP2A Cα蛋白，在4℃结合3 h，500 r/min离心5 min；弃掉上清，然后加入400 μl 0.1 mol/L的PBS洗涤，500 r/min离心5 min；重复洗10次，弃掉上清，加入10 μl的上样缓冲液，95℃变性10 min；吸取上清用于Western印迹分析。

1.3 统计学方法 应用Prism6.0软件行多因素方差分析。

2 结 果

2.1 PP2A Cα基因扩增与克隆 将PP2A Cα基因克隆到载体pFastBac上(图1A为示意图)，使用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，结果表明PP2A Cα基因克隆已成功克隆到pFastBac上(图1B)。经测序进一步鉴定，结果与预期设计一致。

2.2 重组杆状病毒的克隆筛选 重组bacmid转化体的菌落应呈白色，而非重组bacmid转化体的菌落应为蓝色(图2)。挑取白色的单菌斑进行培养，抽提得到重组杆状病毒基因组DNA。以提取的bacmid为模板，用通用引物M13进行PCR鉴定，扩增结果见图3。重组的PP2A Cα bacmid大小应为3 200 bp，而非重组的bacmid为300 bp。笔者选取bacmid 2和3进行后面的实验。

白色的单菌斑应为PP2A Cα bacmid，蓝色的应为空载bacmid图2 蓝白斑筛选重组杆状病毒

1:DNA ladder;2和3:bacmid of PP2A Cα(3 200 bp);4:control bacmid (300 bp)图3 重组杆状病毒PCR鉴定

2.3 重组蛋白的表达 SDS-PAGE检测结果显示，在分子量为36 kD处有条带。为了进一步检测目的基因表达，使用Western印迹检测，结果显示在分子量为36 kD处的确有目的基因表达蛋白,表明PP2A Cα蛋白表达成功。见图4。

A：SDS-PAGE检测PP2A Cα蛋白水平；B：Western印迹检测PP2A Cα蛋白水平图4 重组PP2A Cα蛋白在昆虫细胞Sf9中的表达

2.4 PP2A Cα的功能鉴定 表达的PP2A Cα蛋白活性是对照组的4倍，表明从细胞中表达的PP2A Cα有生物学活性(图5A)。

GST pull-down实验结果显示(图5B)，PP2A Cα可以与α-Syn相互作用。以上结果表明，本研究提取的PP2A Cα既有生物学活性，又有结构学功能。

图5 PP2A Cα蛋白的活性分析

3 讨 论

PP2A是一个重要的丝/苏氨酸残基蛋白磷酸酶，可以使许多病理性蛋白去磷酸化，包括与PD相关的α-Syn蛋白、酪氨酸羟化酶、与AD相关的tau蛋白等，因此参与了老年疾病的发生发展过程〔9～15〕。为了在体内体外实验中探索PP2A功能,有必要建立一种高效的PP2A Cα重组蛋白表达体系。常见的蛋白表达系统包括原核和真核表达系统。原核表达系统最常见的是大肠杆菌表达系统，但该系统会产生包涵体，而且不能产生一些翻译后修饰，这些都不利于重组蛋白保持天然的结构和功能；而真核表达系统可以表达具有天然结构和功能的蛋白，是获得重组蛋白的良好途径。常见真核表达系统包括酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物表达系统。其中昆虫细胞表达系统是目前备受人们推崇的真核表达系统，该系统主要是利用杆状病毒作为外源基因的载体通过感染昆虫细胞来表达外源蛋白，具有很多优点，如安全性好、蛋白表达量高、可以同时表达多个基因等。

首先，笔者利用昆虫杆状病毒表达系统，成功构建了PP2A Cα的重组杆状病毒，并转染到昆虫细胞Sf9中，SDS-PAGE和Western印迹检测结果显示有大量的PP2A Cα蛋白表达；之后，笔者使用活性检测试剂盒检测到了该蛋白活性高于对照组4倍，表明从该体系中表达的PP2A Cα不但表达量高，而且还具有良好的生物学活性。

1 Xing Y,Li Z,Chen Y,etal.Structural mechanism of demethylation and inactivation of protein phosphatase 2A〔J〕.Cell,2008;133(1):154-63.

2 Xing Y,Xu Y,Chen Y,etal.Structure of protein phosphatase 2A core enzyme bound to tumor-inducing toxins〔J〕.Cell,2006;127(2):341-53.

3 Peng X,Tehranian R,Dietrich P,etal.Alpha-synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosine hydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells〔J〕.J Cell Sci,2005;118(Pt 15):3523-30.

4 Yang CC,Kuai XX,Gao WB,etal.Morroniside-induced PP2A activation antagonizes Tau hyperphosphorylation in a cellular model of neurodegeneration〔J〕.J Alzheimers Dis,2016;51(1):33-44.

5 李雪莲，杨翠翠，张 兰.蛋白磷酸酶2A活性调节机制及其在阿尔茨海默病中的作用〔J〕.国际药学研究杂志,2016；43(1):39-43.

6 陈晓娟，闫少春，邵 国.蛋白表达系统的研究进展〔J〕.包头医学院学报,2014；30(3):142-3.

7 Yang W,Wang X,Duan C,etal.Alpha-synuclein overexpression increases phospho-protein phosphatase 2A levels via formation of calmodulin/Src complex〔J〕.Neurochem Int,2013;63(3):180-94.

8 Wang Y,Liu J,Chen M,etal.The novel mechanism of rotenone-induced alpha-synuclein phosphorylation via reduced protein phosphatase 2A activity〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2016;75(1):34-44.

9 王 雪，申甲梅，高 歌，等.PINK1减轻α-突触核蛋白引起的线粒体损伤〔J〕.首都医科大学学报,2016；37(1):70-5.

10 鲁玲玲，施予晴，魏雨菲，等.帕金森病相关基因α-突触核蛋白和PINK1对Nurr1的调节作用〔J〕.首都医科大学学报,2015；36(6):895-901.

11 Spillantini MG,Schmidt ML,Lee VM,etal.Alpha-synuclein in Lewy bodies〔J〕.Nature,1997;388(6645):839-40.

12 Chang C,Lang H,Geng N,etal.Exosomes of BV-2 cells induced by alpha-synuclein:important mediator of neurodegeneration in PD〔J〕.Neurosci Lett,2013;548:190-5.

13 Lou H,Montoya SE,Alerte TN,etal.Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo〔J〕.J Biol Chem,2010;285(23):17648-61.

14 Anderson JP,Walker DE,Goldstein JM,etal.Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease〔J〕.J Biol Chem,2006;281(40):29739-52.

15 Martin L,Latypova X,Wilson CM,etal.Tau protein phosphatases in Alzheimer′s disease:the leading role of PP2A〔J〕.Ageing Res Rev,2013;12(1):39-49.

〔2016-11-01修回〕

(编辑 曲 莉)

Expression of protein phosphatase 2A Cα by the insect baculovirus and its activity analysis

QU Jing, ZHENG Yuan, REN Xiao-Xi,etal.

Department of Neurobiology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Center for Parkinson′s Disease, Beijing Institute for Brain Disorder, Key Laboratory for Neurodegenerative Disease of Ministry of Education, Beijing 100069, China

Objective To construct the recombinant baculovirusof protein phosphatase 2A(PP2A)Cα and express the PP2A Cα protein in insect cells.Methods Firstly,the gene of PP2A Cα was cloned into pFastBac and transpositioned into the genome of insect baculovirus.Then, the PP2A Cα protein was expressed in the insect Sf9 cells by the recombinant baculovirus.Finally, PP2A Cα activity was assayed.Results The protein of PP2A Cα was successfully expressed in the insect cells and it showed its biological activity.Conclusions The insect baculovirus could be used to express the PP2A Cα protein.

Insect baculovirus;Protein phosphatase 2A

国家自然科学基金(31271136,31571202)；北京市属高等学校青年拔尖人才培养计划(CIT&TCD201504087)；北京市教委科技计划(KZ201210025020)

张建亮(1976-)，男，副教授，主要从事帕金森病相关蛋白结构功能关系的研究。

渠 静(1990-)，女，在读硕士，主要从事帕金森病相关蛋白结构功能关系的研究。

R816

A

1005-9202(2017)07-1571-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.004