小反刍兽疫病毒在自然感染羊体内的病毒分布

何世成 ， 郭 威 ， 王昌建 ， 舒晓亮 ， 宋跃君 ， 王卫国 ， 鲁杏华 ， 唐小明 ， 林 源 ， 邱立新 ， 刘文泽

(1.湖南省动物疫病预防控制中心， 湖南长沙410014； 2.湖南省怀化市动物疫病预防控制中心， 湖南怀化418000； 3.湖南省常德市动物疫病预防控制中心， 湖南常德415000)

小反刍兽疫病毒在自然感染羊体内的病毒分布

何世成1， 郭 威1， 王昌建1， 舒晓亮2， 宋跃君1， 王卫国1， 鲁杏华1， 唐小明1， 林 源1， 邱立新1， 刘文泽3

(1.湖南省动物疫病预防控制中心， 湖南长沙410014； 2.湖南省怀化市动物疫病预防控制中心， 湖南怀化418000； 3.湖南省常德市动物疫病预防控制中心， 湖南常德415000)

为了解小反刍兽疫病毒在自然感染羊体内的分布情况，平行采集临床发病羊的脾脏、肺脏、心脏、肝脏、肾脏、大肠、淋巴结以及眼拭子、鼻拭子、肛门拭子、血清等样品，应用荧光RT-PCR方法对各样品进行平行检测，比较各样品检测Ct值，评估病毒分布和各样品中的病毒含量，结果显示，所有样品小反刍兽疫病毒核酸均为阳性，其中大肠、肺脏、脾脏和淋巴结的检测Ct值较小，表明小反刍兽疫病毒在自然感染羊体内呈全身分布，但在大肠、肺、脾和淋巴结等组织中的含量较高。

小反刍兽疫病毒 ； 荧光RT-PCR ； 病毒分布

小反刍兽疫(PPR)是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbolivirus)的小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种严重的烈性、高度接触性传染病，主要感染小反刍兽，特别是山羊和绵羊高度易感，野生动物也偶然发生。该病是OIE规定必须上报的传染病之一，是我国的一类动物疫病。1942年该病首次报道发现于非洲西部的象牙海岸，2007年该病首次传入我国西藏，但被及时控制，疫情未得到扩散，2013年疫情再次传入，2014年在21个省发生小反刍兽疫疫情共260起，给我国养羊业造成了巨大的损失[1-3]。为了解自然感染羊后PPRV在体内的分布情况，应用荧光RT-PCR方法，平行检测发病羊各部位样品，评估病毒组织分布及含量，以期为致病机理研究和临床诊断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 发病病料的采集与处理 病料采自湖南省内经国家外来动物疫病研究中心确诊的小反刍兽疫疫情场，扑杀并无菌采集疫情场内4头发病症状明显羊的心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、大肠、眼拭子(PBS)、鼻拭子(PBS)、肛门拭子(PBS)以及血液。在实验室内对血液样品进行离心，取血清备用；组织剪取0.5 g左右，加入适量PBS进行碾磨，离心取上清备用。

1.2 主要试剂与仪器 小反刍兽疫荧光RT-PCR检测试剂盒为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司产品；磁珠法核酸提取试剂盒为苏州天隆生物科技有限公司产品；ABI 7500fast荧光定量PCR仪，Retsch MM400组织碾磨仪，西安天隆全自动核酸提取仪。1.3 核酸的提取及实时荧光RT-PCR反应 分别提取4头发病羊的心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、大肠、眼拭子、鼻拭子、肛门拭子和血清等样品的核酸，并分别进行荧光RT-PCR扩增，操作按试剂盒说明书进行。

2 结果与分析

2.1 样品检测结果 4头发病羊的心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、大肠、眼拭子、鼻拭子、肛门拭子和血清等样品均出现明显的扩增曲线，Ct值均在34以下，为PPRV核酸阳性。

2.2 各样品PPRV核酸检测Ct值 不同发病羊、不同样品PPRV检测均为阳性，但Ct值不尽相同(表1)，表明PPRV感染羊后虽然呈全身分布，但病毒含量并不一致，4头发病动物不同样品最高Ct值和最低Ct值相差在19.95～24.91之间，平均差异为22.12，病毒含量相差近420万倍(222)；有2头发病动物最低Ct值的组织是肺，1头为大肠，1头是眼拭子；平均值结果显示，肺、大肠、脾、眼拭子、鼻拭子等样品中的含量较高，心、肝、肾、淋巴结、肛拭子等样品次之，血清含量最低。

表1 样品检测结果Ct值明细

3 讨论

3.1 小反刍兽疫为传入我国的外来动物疫病，在国内流行初期的样品类型选择上比较混乱，本研究结果显示，发病动物的大部分组织和拭子样品均可检测出病毒，但相比较而言，肺、大肠、脾、淋巴结等组织以及眼拭子、鼻拭子等样品病毒含量较高，考虑到样品保存储运以及病毒稳定性等因素，临床采集肺、脾、淋巴结等组织样品可基本满足实验室诊断检测需要。

3.2 检测结果显示，有3头发病羊组织的最低Ct值在10以下，另1头组织中的最低检测Ct值为15以上，表明本试验中的4头自然感染羊可能处于不同的发病阶段，且不同发病阶段动物体内各组织病毒含量差距较大；另外，同一动物，不同样品的病毒含量也有差异，4头发病羊各样品的最高Ct值和最低Ct值的差异平均达22.12，根据荧光PCR技术原理[4]，病毒含量的相对差值达420万倍(222)，表明PPRV自然感染羊以后具有较明显的组织嗜性，含量高的组织可能为PPRV繁殖部位，含量低的组织可能是受病毒血症的影响，而眼、鼻、肛门等部位的拭子样品Ct值与组织中的最低Ct值接近，反映的是PPRV在体内繁殖后通过眼鼻分泌物和粪便排泄物的方式向外大量排出病毒，与PPRV致病机理基本一致[5-6]。

3.3 对病毒体内分布的研究方法有免疫组化法、PCR方法、荧光PCR方法等[7-10]，由于荧光PCR方法可数字化比较目标基因的含量，且敏感性高，操作方便，越来越多的被用于病毒体内分布的评估分析[11]。为确保得出较准确的相对定量结果，本研究在样品处理时对剪取的组织进行了称重，样品的处理、核酸提取、荧光RT-PCR扩增都同步进行，确保过程一致，最大限度减少操作误差，所得试验数据比较准确的反映了相对量值，对准确评估PPRV在自然感染羊体内分布的相对状况有积极意义。

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Distribution of Peste des Petits Ruminants virus in naturally infected goats

HE Shi-cheng1, GUO Wei1, WANG Chang-jian1, SHU Xiao-liang2, SONG Yue-jun , WANG Wei-guo1, LU Xing-hua1, TANG Xiao-ming1, LIN Yuan1, QIU Li-xin1, LIU Wen-ze3

(1.Animal disease prevention and control center of Hunan， Changsha 410014,China； 2.Animal disease prevention and control center of Huaihua,Huaihua 418000,China； 3.Animal disease prevention and control center of Changde， Changde 415000,China)

In order to survey the distribution of peste des petits ruminants(PPR)virus in goats after naturall infection,real-time quantitative PCR was used to detect the samples collected from spleen,lung,heart,liver,kidney,large intestine,lymph nodes,ocular swab,nasal swab,anal swab and serum in infected goats.The results showed that all the samples were positive and the cycle threshold value is low in large intestine,lung,spleen and lymph nodes,indicating that PPR virus invades all major organs and has the strongest tropism to large intestine,lung,spleen and lymph nodes.

Peste des Petits Ruminants virus ； fluorescent quantitative RT-PCR ； virus distribution

2016-04-29

何世成(1978- )，男，高级兽医师，硕士，从事动物疫病防控工作，E-mail：784971815@qq.com

S852.651

A

0529-6005(2017)03-0021-02