影响油乳剂乳液疫苗稳定性的因素及其评价方法

刘华杰

(佛山市三水灏诚合成树脂有限公司，广东 佛山 528143)

影响油乳剂乳液疫苗稳定性的因素及其评价方法

刘华杰

(佛山市三水灏诚合成树脂有限公司，广东 佛山 528143)

本文介绍了各种影响油乳剂乳液疫苗稳定性的因素。从物化性质方面指出了混合乳化剂的HLB值与浓度、油水相比、助悬剂（硬脂酸铝）的浓度等对油乳剂乳液疫苗稳定性的影响；又从仪器和操作指标方面指出了仪器乳化强度、乳化时间、制备方式等对油乳剂疫苗稳定性的影响。结合乳状液的稳定性分析方法，总结出适合油乳剂灭活疫苗稳定性的评价方法，如离心破乳法、静置高温或冷冻沉降法、电导率法、相对分布法等。

油乳剂；灭活疫苗；乳化技术；稳定性

禽类传染病，尤其是病毒性传染病主要靠疫苗接种进行预防。灭活疫苗是指将病原微生物经物理或化学方法灭活后，失去其感染能力，但仍然保持其免疫原性，接种后能使动物产生特异性抵抗力的生物制剂。由于灭活疫苗接种后不能在动物体内繁殖，因此使用剂量较大，免疫期较短，但加入适当的佐剂后可增强免疫效果，延长免疫期。油乳剂乳液疫苗[1]是以矿物油为佐剂与灭活后的抗原液混合乳化制成的，它以其吸收缓慢、免疫刺激持续，免疫保护期长的特点在疫苗的应用方面有着不可替代的作用，但油乳剂乳液疫苗在制作过程中由于仪器与操作指标、油乳剂本身物理化学性质和保存条件等因素的影响，往往造成油乳剂乳液疫苗的不稳定性，影响了油乳剂乳液疫苗的实际应用，这一问题已经极大的影响了疫苗的免疫效果。本文从油乳剂本身的物理化学性质与仪器和操作指标方面分析各种影响油乳剂乳液疫苗稳定性的因素，同时结合了乳状液的稳定性分析方法，总结出适合油乳剂疫苗稳定性的评价方法。

1 影响油乳剂乳液疫苗稳定性的因素

1．1 物化性质 它包括界面膜的物理性质、粘度、油水相比以及助悬剂等，是影响油乳剂灭活疫苗稳定性的最主要的因素。

1．1．1 表面活性剂 非离子表面活性剂具有低毒性、低刺激性等特点，大量用于医药乳状液中。油乳剂灭活疫苗中使用的表面活性剂大多为非离子表面活性剂中的Span-80与Tween-80混合表面活性剂，其中Span-80是亲油性的表面活性剂，Tween-80是亲水性的表面活性剂。表面活性剂对油乳剂的稳定性影响方面主要有界面张力、HLB值、界面膜的大小厚薄和粘度、液滴颗粒的大小等。要获得优良的油乳剂，应将灭活液高度分散于白油中，就要使油与水的界面张力降低，表面活性剂的一个主要功能就是降低界面张力，从而使水相分散于油相之中。但是，单纯的水/油界面张力的高低主要表明了油乳剂形成之难易，并非油乳剂稳定性的必然衡量标志[2]。

自从Griffin[3]提出HLB方法作为选择乳化剂的标准后，混合乳化剂的HLB值就成为制备稳定乳状液的重要参数，油乳剂中的HLB值的调整主要利用Span-80与Tween-80的配比来进行。具有良好免疫效果的油乳剂多为W/O型，油相为白油，这需要在一定的 HLB值范围内达到，一般HLB值小于8。HLB值对油乳剂的稳定性有着非常大的影响，且不同的活性剂用量所需要的最佳的 HLB值也不同，一般来说[4]，活性剂的用量越大，体系的最佳HLB值是增加的。

在灭活液(以下简称水相)/油体系中加入表面活性剂后，界面张力降低，同时界面发生吸附，形成界面膜。界面膜具有一定强度，对分散相液珠在有保护作用，使得液珠在相互碰撞时不易聚结。当表面活性剂浓度低时，界面上吸附的分子少，界面膜的强度差，形成的油乳剂稳定性亦差。表面活性剂浓度升高至一定程度后，液珠的粒径显著减小，界面膜由比较紧密排列的、定向的吸附分子所组成，膜的强度相应较大，油乳剂液珠聚结时受到的阻力较大，故形成的油乳剂稳定性较好。随着表面活性剂浓度的进一步上升，活性剂分子之间相互凝聚下沉而导致油乳剂分层。在制备油乳剂时，表面活性剂需要加入足够量，才能有最佳的乳化效果，同时必需考虑到生产效益和油乳剂的稳定加入最佳浓度的表面活性剂。研究发现，单一、纯净的表面活性剂所形成的界面吸附膜的膜排列不够紧密，膜强度不高。而混合的表面活性剂，以及混有杂质的表面活性剂，则比单一、纯净的膜强度大为提高，表面吸附分子排列紧密。Span-80与Tween-80组成的混合表面活性剂在油乳剂灭活疫苗中得到了广泛的使用。一般认为[3]，在混合表面活性剂使用后，界面上有“复合物”生成，膜的强度增加，表面张力降至极低值且不易破裂，因此液珠不易聚结，油乳剂更稳定。

1．1．2 油水相比 油水相比对液珠颗粒大小、粘度以及油乳剂乳状液的类型都有重要影响。油乳剂粘度影响油乳剂灭活疫苗的稳定性，粘度越大，则分散相液珠运动速度越慢，有利于油乳剂的稳定。在油乳剂灭活疫苗中，灭活液是内相，白油是分散相，灭活液的比例越高，粘度越大[3]。低粘度容易造成油乳剂不稳定，高粘度不能用于机体免疫，不适合静脉注射，因此油水相比的大小有一定范围。由于不同油乳剂中表面活性剂的量与油水相比不同，液珠的大小分布也不同，适中的液珠大小有利于油乳剂的稳定，大液珠在重力场中容易沉降，小液珠由于布朗运动相撞引起聚结。此外油乳剂中液珠颗粒大小分布情况也会影响油乳剂的稳定性，液珠颗粒大小平均的油乳剂较液珠颗粒大小分布较不均的油乳剂稳定得多。对于油乳剂来说，理想的液珠是大小适中且均匀的球形，此时油乳剂疫苗最为稳定。油水相比的改变能影响液珠颗粒大小，使得液珠大小不均匀。这是因为极端情况下液珠被挤成大小形状皆不同的多面体，这种油乳剂极不稳定；并且油水相比低则不能充分利用油乳剂，造成浪费。多数的生产中的灭活液与白油的体积之比为 1：1、1：2、1：3，比例的大小视所需的灭活疫苗的剂量、需要的粘度以及稳定性来定。

1．1．3 硬脂酸铝 硬脂酸铝作为助悬剂用于油乳剂之中。加入适量可减少液珠的沉降，增强油乳剂的内相粘度，降低液珠之间的碰撞几率，最终影响油乳剂的稳定性。但硬脂酸铝加入过多后粘度上升过快导致油乳剂灭活疫苗不适合注射。用1ml的吸管吸取25℃左右的疫苗1ml，另其自然流出，记录流出0.4ml所需要的时间，3次流出时间平均在6～8s为宜，因此加入油乳剂灭活疫苗中的硬脂酸铝必须适量，根据油/水相比的不同而进行调整。资料显示[5]当油相中硬脂酸铝含量与油/水比分别为2%和3:1、1%和2:1以及0.5%和1:1时，制备的质量达到了国家标准。

1．2 仪器和操作指标

1．2．1 制备油乳剂的方式 油乳剂的制备方式较为简单，通用的方法一般有两种，一种是剂在油中法：将水相和油相分别配制，油相的主要成分为白油、Span-80和硬脂酸铝；水相主要为病毒灭活液、Tween-80、生理盐水。在激烈的持续搅拌下将水相加入油相，加入的时间宜长，使得两相能充分混合，较短则对油乳剂的稳定性不利[6]，一般 60s以内为宜；另一种为剂在水中法：配置方法大致相同，加入时是在激烈的持续搅拌下将油相加入水相，油乳液由O/W型逐渐转变为W/O型。两种方法都能制备出稳定的油乳液。此外，在HLB值不变的情况下，不同的方法制备水相和油相以及白油、Span-80和硬脂酸铝的加入与加热的先后对油乳剂疫苗的稳定性也有影响。

1．2．2 乳化强度和时间 制备油乳剂的设备一般有搅拌器、均化器、齿轮泵、超声乳化器、胶体磨等。对于大规模的油乳剂灭活疫苗制备，一般采用均质器。高压均质器可快速的制备比较均匀的油乳剂。实验室研究中常采用高速均质器。

仪器乳化速率和时间对油乳剂稳定性的影响极大，分散相在强大机械力的作用下分散越来越均匀，故形成的油乳剂颗粒越均匀细密[7]，油乳剂就越稳定。但当乳化强度达到一定程度后继续增大强度，油乳剂的稳定性提高较小，颗粒之间碰撞较多，容易破乳；再者高速剪切搅拌对于高粘度体系生热更为明显，大量的机械能被转化为热的形式散失掉。从经济性角度出发，实验应选用合适的乳化速率一般为8000rpm为佳，对于胶体磨和高压均质器来说，还要有一定的乳化压力，这需要乳化速率与乳化压力的配比，即为乳化强度，乳化压力为30P为宜[8]。

混合乳化剂存在下，油水两相经强烈搅拌乳化形成比较稳定的乳状液需要一定时间，约为10～15min。在到达该时间之前，油乳剂的稳定性随着搅拌乳化时间的增加而增加，超出该时间后，油乳剂中的液珠可能因为相互碰撞和离心沉降的作用有聚结的趋势，影响油乳剂的稳定性。

1．2．3 乳化温度 油乳剂为O/W型，使用非离子乳化剂，它随温度的降低亲油性减弱，亲水性增强，同时在某一临界温度下会发生相转变，即相转变温度[9]。对于用非离子表面活性剂稳定的O/W型油乳剂灭活疫苗来说，PIT（相转变温度）应当比室温低10～40℃，因此乳化温度在25℃以下效果较好，才可保证在储存过程中不因温度降低而发生向O/W乳状液的转向。乳化温度越接近PIT，液珠越均匀，油乳剂越稳定。

2 油乳剂乳液疫苗稳定性的评价方法

油乳剂是热力学不稳定体系，长期放置必然会导致破乳。油乳剂的不稳定性一般有5种表现形式：分层、聚结、絮凝、破乳和变形[10]。油乳剂灭活疫苗的稳定性与油乳剂灭活疫苗的免疫效力密切相关，油乳剂灭活疫苗不稳定，灭活疫苗的吸收就不好，对机体的刺激不够，免疫效果大大降低，不能使用。

由于油相和水相密度不同，在重力作用下液珠将下沉并在乳状液中建立起平衡的浓度梯度，这个过程称为分层，它是油乳剂的不稳定性主要表现。虽然分层使乳状液的均匀性遭到破坏，但乳状液并未真正破坏，上层清油比原来多，而下层比原来少。由重力作用引起的分层，其沉降速度与内外相密度差、外相的粘度、液珠的大小等因素有关。分层的速度符合 Stokes定律[3]：

Stokes定律中的重力常数g为w2R所代替，式中w是离心器的角速度，R是试样与转动轴的距离，r为粒子半径，d1为水相密度，d2为油相密度，η为油相的粘度。油乳剂在静置状态下分层的速度与重力常数成正比，粒子半径和密度相差越大，粘度越小则越易分层。当分层到达一定程度后就会产生破乳，这是油乳剂最后变成油水两相分离状态的过程，这时两相界面清晰可见。

油乳剂的稳定性可采用是否分层或者分层的程度来定义[11]，通常有静置实验、离心分离、静置高温或冷冻沉降、电导率测定和粒度分布等测定方法。下面介绍几种常用的稳定性检测方法。

2．1 离心分离法 离心破乳法是目前常用的油乳剂稳定性评价方法，离心的作用可使分层加速。在此情形下，Stokes定律中的重力常数g为w2R所代替。

显然，我们可使w2R比g大许多倍（事实上比地心引力大数千倍并非难事）。倘若假设普通的分层速度与重力成正比，则在离心力场中的速度可以预知。离心法的测定结果受两个因素的影响，即离心时间和离心速度。一般情况下将油乳剂在3000rpm的速度下离心15～20min，如果在此状况下油乳剂灭活疫苗不分层则可认为稳定性达到要求。

2．2 静置高温或冷冻沉降法 这是较为常用的试验方法，是通过体系的热负荷变化，了解并判断油乳剂的稳定性[9]。高温有利于降低油乳剂的粘度，降低液膜厚度，增加液珠碰撞几率。冷冻使得液珠的体积增大，液膜的厚度减少；表面活性剂聚结，出现裂缝，增加了破乳率。高温或低温的方法使油乳剂分层较一般的静置分层快10倍以上。一般来说，高温沉降法所需要的温度为40℃～60℃，冷冻沉降法所需要的温度为0～-10℃。该法可以较为直观的分析出不同油乳剂的稳定性，比较出任何时刻不同油乳剂的分层现象。

2．3 电导率法 与以上两种方法不同，该法能较为精确的分析出油乳剂的分离程度，也可与以上几种方法联用，达到更好的分析效果。由于一些乳状液的油水分层界面不够清晰,应用传统的分相法来研究乳状液稳定性受到限制，不同油乳剂具有不同的电性质。由于水是电的良导体，因而O/W型乳状液的电导率较之W/O型要大。通过同一高度处油乳剂电性质的测定，可有效地确定油乳剂的稳定性[12]。直接应用电导率曲线可研究油乳剂乳化的体系的稳定性。通过对油乳剂电导率的测定，随着破乳分层，油相中含水量不断减少，电导率相应减小，即可表征油乳剂的破乳率，分析油乳剂的稳定性。

2．4 相对分布法[13]先将配置好的油乳剂在35～40℃的温度下静置120h，用长吸管分别将上下层的油乳液吸出，然后往上下两乳液样品中各加入少量配好的高价离子溶液，放入90℃下恒温水中破乳，直至油水完全分清。读出上下两部分样品的清水层体积。计算上下两部分样品中水相体积相对比值V上/V下(%)，以此表示油乳液分散相均匀分布程度在恒温静置一定时间后的变化。若某油乳剂的上下部分水相体积相对比最接近于100%，则视该乳状液为最稳定乳状液。油乳液稳定性可用相对分布法定量地来评价，用简单的方式和仪器获得比目测法更准确的结果。

3 结语

综上所述，影响油乳剂乳液疫苗稳定性因素主要是油乳剂本身物化性质和乳化工艺与技术两种因素。而稳定性的检测主要有静置、离心分离、静置高温或冷冻沉降、电导率测定和相对分布法等方法。目前有关油乳剂稳定性的理论还不成熟，绝大多数厂家的疫苗生产还是停留在经验阶段，因此在理论上更深入地探讨油乳剂的稳定性是以后科研的方向。

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S852.4+3

A

1673-1085（2017）03-0052-04

2017-02-20

刘华杰（1981-），男，湖南永兴人，工程师，硕士，从事乳液疫苗化学方面研究，邮箱：blackjacket@126.com。