长链脂肪乳剂逆转布比卡因导致的心肌细胞膜流动性降低

陈哲，赵施施，林婷婷，刘巧艳，董娇娇，徐旭仲

（温州医科大学附属第一医院 麻醉科，浙江 温州 325015）

长链脂肪乳剂逆转布比卡因导致的心肌细胞膜流动性降低

陈哲，赵施施，林婷婷，刘巧艳，董娇娇，徐旭仲

（温州医科大学附属第一医院 麻醉科，浙江 温州 325015）

目的:研究长链脂肪乳剂对布比卡因所致心肌细胞膜流动性改变的影响。方法:采用NBD-C6-HPC特异性荧光探针标记心肌细胞膜脂质，借助激光共聚焦显微镜结合光脱色荧光恢复技术检测布比卡因及长链脂肪乳剂对心肌细胞膜流动性的影响。结果:对照（Con）组和1%体积分数长链脂肪乳剂（LCT）组比较，细胞膜流动性差异无统计学意义（P＞0.05）。布比卡因1 000 μmol/L（Bu-1000组）细胞膜的荧光恢复率与Con组、LCT组、布比卡因100 μmol/L（Bu-100）组比较显著降低（P＜0.01）；Bu-1000组细胞膜的扩散系数显著低于Con组（P＜0.05）和LCT组（P＜0.01）。布比卡因1 000 μmol/L+1%体积分数长链脂肪乳剂（Bu-1000+ LCT）组细胞膜荧光恢复率（P＜0.05）及扩散系数（P＜0.01）显著高于Bu-1000组。布比卡因100 μmol/L+ 1%体积分数长链脂肪乳剂（Bu-100+LCT）组细胞膜扩散系数（P＜0.01）显著高于Bu-100组。结论:长链脂肪乳剂能够逆转布比卡因导致的心肌细胞膜流动性降低。

脂肪乳剂；布比卡因；光脱色荧光恢复技术；膜流动性；荧光恢复率；扩散系数

近年来脂肪乳剂逆转长效酰胺类局麻药心脏毒性的研究在国际上成为研究热点。但脂肪乳剂逆转布比卡因心脏毒性的机制尚无法用脂质包裹（lipid sink）理论[1-2]和能量代谢（lipid flux）理论[3]来完全阐释，必然存在其他机制[4]。TSUCHIYA等[5]采用人工生物膜研究局麻药对生物膜流动性的影响，结果显示局麻药通过增加人工生物膜流动性产生心肌细胞毒性。但尚未见有关直接利用体外心肌细胞进行局麻药膜流动性影响的研究。本研究在体外心肌细胞上，采用激光共聚焦显微镜结合光脱色荧光恢复技术（fluorescence recovery after photo-bleaching，FRAP）检测心肌细胞膜流动性，研究长链脂肪乳剂和布比卡因对细胞膜流动性影响，探讨长链脂肪乳剂对布比卡因导致的细胞膜流动性降低是否有逆转作用，从而为脂肪乳剂逆转布比卡因心脏毒性提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:心肌细胞（H9c2细胞）由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

1.1.2 试剂:20%长链脂肪乳剂（批号H19993197，华瑞制药有限公司，无锡）；盐酸布比卡因（批号100995995，Sigma公司，美国）；DMEM培养基（Gibco公司，美国）；胎牛血清（Hyclone公司，美国）；NBDC6-HPC荧光探针（N-3786，Gibco公司，美国）。

1.1.3 仪器:共聚焦显微镜（A1型，Nikon公司，日本）；细胞培养箱（311型，Thermo公司，德国）；微量移液器（Eppendof，Thermo公司，德国）；冰箱（BCD-216型，青岛海尔股份有限公司）；免疫组织化学法专用保湿盒。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:H9c2细胞用含10%胎牛血清和青链霉素（青霉素100 U/mL，链霉素0.1 mg/mL）的高糖DMEM培养液，在37 ℃、5% CO2恒温培养箱内培养，隔天更换培养基，当细胞生长到培养皿底面80%左右时，进行细胞传代。

1.2.2 细胞爬片及建模:收集对数期细胞，以每孔5×104的细胞密度，接种至24孔板爬片。待培养过夜细胞贴壁后，按照实验分组进行药物共同培养24 h。实验分组如下:①对照（Con）组；②1%体积分数长链脂肪乳剂（LCT）组；③布比卡因100 μmol/L（Bu-100）组；④布比卡因1 000 μmol/L（Bu-1000组）；⑤布比卡因100 μmol/L+1%体积分数长链脂肪乳剂（Bu-100+LCT）组；⑥布比卡因1 000 μmol/L+1%体积分数长链脂肪乳剂（Bu-1000+LCT）组。

1.2.3 细胞膜流动性检测:①弃去培养液，用预冷的D-Hanks漂洗细胞3次，每孔加入预冷的探针工作液2.5 μmol，4 ℃避光孵育10 min；②再次用预冷的D-Hanks漂洗细胞3次，取出细胞爬片，20%甘油-D-Hanks封片于载玻片上；③立即上机检测:标记活细胞某一区域，高强度激光束照射；再以较弱的荧光束（488 nm）持续照射该区域做连续实时观察，每0.134 s记录1次光密度，观察细胞荧光恢复程度及速度，所有测量在室温下进行。

1.3 数据处理 计算机给出选定细胞在漂白前后各时间点的荧光强度曲线图，根据计算公式计算荧光恢复率（R）及扩散系数（D），公式如下[6-8]:

其中F1为漂白恢复后的荧光强度，F2为漂白前的荧光强度，F0为漂白后即刻荧光强度。

其中β为矫正系数，ω为漂白区域半径，t1/2为荧光恢复一半所需的时间。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。计量资料以±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，2组间进一步比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 1%长链脂肪乳剂和布比卡因对心肌细胞膜流动性的影响 Con组、LCT组、Bu-100组3组间比较，细胞膜的R值、D值均差异无统计学意义（均P＞0.05）。Bu-1000组细胞膜的R值与Con组、LCT组、Bu-100组比较显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；Bu-1000组细胞膜的D值显著低于Con组（P＜0.05）和LCT组（P＜0.01），见图1。

2.2 长链脂肪乳剂对布比卡因导致细胞膜流动性改变的影响 Bu-100+LCT组细胞膜的D值显著高于Con组和Bu-100组（P＜0.01）；3组间R值比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。Bu-1000+LCT组细胞膜的D值显著高于Con组（P＜0.05）和Bu-1000组（P＜0.01）；Bu-1000+LCT组的R值显著高于Bu-1000组（P＜0.05），见图3。

3 讨论

细胞膜流动性，是指构成膜的脂质和蛋白质分子的运动性。流动性不仅是细胞膜的基本特性之一，也是细胞进行生命活动的必要条件。跨膜物质运动、细胞信号传递、细胞识别、细胞免疫、细胞分化以及激素的作用等都与细胞膜有着密切的关系。当膜的流动性低于一定的阈值的时候，许多酶的活动以及跨膜运输将停止，反之如果流动性过高，也同样会造成膜上酶和通道受体的功能障碍。细胞膜流动性受到多因素的影响，一般来说细胞膜脂中胆固醇/磷脂比值是决定膜流动性的重要因素之一，胆固醇/磷脂比值越低，则细胞膜流动性越高，反之亦然[9]。另外，膜流动性的大小与膜脂中不饱和脂肪酸含量高低有关。不饱和脂肪酸含量越高，膜流动性越大[10-12]。

图1 1%长链脂肪乳剂和布比卡因对心肌细胞膜流动性的影响

图2 长链脂肪乳剂对Bu-100组所致细胞膜流动性改变的影响

图3 长链脂肪乳剂对Bu-1000组所致细胞膜流动性改变的影响

本研究采用的长链脂肪乳剂注射液，由卵磷脂和大豆甘油三酯制作而成，其颗粒大小、体内代谢特征均类似于乳糜微粒。脂肪乳剂所含的卵磷脂作为磷脂的一种，是构成生物膜的重要组成成分，可保证膜的流动性和生物学功能。另外，大豆甘油三酯富含ω-6多不饱和脂肪酸，多不饱和脂肪酸在膜流动性中也起到重要作用。NANO等[12]用多不饱和脂肪酸培养Caco-2细胞，结果表明多不饱和脂肪酸能增加细胞膜的流动性，并呈剂量依赖性。本研究结果显示1%长链脂肪乳剂对正常心肌细胞的膜流动性没有影响。WANTEN等[13]将人离体中性粒细胞分别与长链脂肪乳剂和中长链脂肪乳剂共同孵育，结果表明长链脂肪乳剂对细胞膜流动性无显著影响，这一结果和本研究结果一致。

TSUCHIYA等[5]报道酰胺类局麻药能够增加人工膜流动性且排列顺序如下:布比卡因＞罗哌卡因＞利多卡因＞丙胺卡因＞甲哌酰卡因，和酰胺类局麻药临床效能强度顺序相一致；同时指出随着pH值的降低，局麻药对人工膜流动性的增强作用减弱。随后该团队研究局麻药对于不同磷脂/胆固醇比例的人工膜流动性的影响时指出，局麻药对于增加阴离子磷脂含量高的人工膜的流动性更显著:心磷脂＞磷脂酸＞磷脂酰甘油＞磷脂酰丝氨酸；局麻药是通过静电作用和疏水作用与带负电荷的磷脂发挥作用，为局麻药心脏毒性膜结构选择性提供线索[14]。和以上研究不同，本研究结果显示100 μmol/L布比卡因对心肌细胞膜流动性影响不显著，但1 000 μmol/L布比卡因使得心肌细胞的荧光恢复率和扩散系数显著降低，反而抑制了心肌细胞膜的流动性。出现与TSUCHIYA等[5]研究结果不同的原因主要考虑以下2点:①TSUCHIYA等[5]采用的是按不同磷脂/胆固醇比例合成的人工生物膜。而正如其结果所示阴离子含量的增加显著提高局麻药增加膜流动性的效能，表明人工膜成分对局麻药效应的影响是不可忽视的。而本研究是采用H9c2细胞直接进行实验，膜成分比例更加贴近原代心肌细胞。②本研究布比卡因与H9c2细胞共同孵育时长为24 h，而上述研究中局麻药和人工膜作用时间相对较短，分别为10 min和5 min。可能短时间处理对生物膜仅仅是一个应激刺激，而长时间处理对生物膜才起到真正的毒性作用，这一假设将在进一步的实验中进行验证。

本研究结果显示1%长链脂肪乳剂对正常心肌细胞的膜流动性没有影响，但和布比卡因共同作用时，能够显著逆转1 000 μmol/L布比卡因导致的心肌细胞膜流动性降低，对100 μmol/L布比卡因同样能够显著提高扩散系数。表明长链脂肪乳剂对于处于抑制状态的细胞膜作用强于正常细胞膜。这样一来，长链脂肪乳剂对细胞膜流动性的直接作用为脂肪乳剂逆转布比卡因心脏毒性提供理论依据。

本研究的主要缺陷在于没有观察布比卡因对细胞膜抑制的剂量-效应关系以及长链脂肪乳剂逆转布比卡因所致心肌细胞膜流动性降低的剂量-效应关系，所以布比卡因和长链脂肪乳剂的剂量方案未必为最佳。

综上所述，长链脂肪乳剂并不能够增加正常心肌细胞膜的流动性，但对于布比卡因处理后流动性受到抑制的心肌细胞，起到逆转其流动性的作用。

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（本文编辑：吴昔昔）

Long-chain lipid emulsion reverse the decrease of cardiomyocyte membrane f uidity induced by bupivacaine

CHEN Zhe, ZHAO Shishi, LIN Tingting, LIU Qiaoyan, DONG Jiaojiao, XU Xuzhong.
Department of Anesthesiology, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To study the effects of long-chain lipid emulsion on the changes of membrane f uidity induced by bupivacaine in H9c2 cardiomyocyte.Methods:By the combination of confocal laser scanning microscope and f uorescence recovery after photobleaching, the effects of long-chain lipid emulsion and bupivacaine on the membrane f uidity in H9c2 cardiomyocyte, whose membrane phospholipid was labelled with NBDC6-HPC specif c f uorescent probes, were determined.Results:Comparing with the Con group, the LCT group showed no signif cant difference in membrane f uidity. The Bu-1000 group showed a decreased recovery ratio when compared with the Con group (P＜0.01), LCT group (P＜0.01) and Bu-100 group (P＜0.01), and a decreased diffusion coeff cient when compared with the Con group (P＜0.05) and the LCT group (P＜0.01). Compared with Bu-1000 group, the Bu-1000+LCT group showed an increased recovery ratio (P＜0.05) and an increased diffusion coeff cient (P＜0.01). Compared with Bu-100 group, the Bu-100+LCT group showed an increased diffusion coeff cient (P＜0.01).Conclusion:Long-chain lipid emulsion can reverse the decrease of membrane f uidity induced by bupivacaine in H9c2 cardiomyocyte.

lipid emulsions; bupivacaine; f uorescence recovery after photobleaching; membrane f uidity; recovery ratio; diffusion coeff cient

R614.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.005

2016-04-11

浙江省自然科学基金资助项目（Y13H090050）。

陈哲（1989-），男，浙江温州人，硕士生。

徐旭仲，教授，主任医师，硕士生导师，Email:xuzhong@ 263.net。