慢病毒介导microRNA-214在成牙骨质细胞分化过程中的作用

孙福财，刘雪婷，蔡志斌，张金华

（1.温州医科大学附属第一医院 口腔科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学附属口腔医院 口腔综合科，浙江 温州 325027）

慢病毒介导microRNA-214在成牙骨质细胞分化过程中的作用

孙福财1，刘雪婷1，蔡志斌2，张金华1

（1.温州医科大学附属第一医院 口腔科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学附属口腔医院 口腔综合科，浙江 温州 325027）

目的:构建microRNA-214沉默慢病毒载体并研究其在成牙骨质细胞分化过程中的作用。方法:常规条件下培养成牙骨质细胞系，并对其进行矿化诱导，检测牙骨质分化及矿化相关标记物的变化。随后，构建microRNA-214沉默慢病毒载体并感染成牙骨质细胞，荧光显微镜观察其感染效率，并用茜素红和Von kossa染色检测不同组成牙骨质细胞的矿化能力，最后检测不同组之间牙骨质分化标志物的变化。结果: Real-time PCR结果显示，随着诱导时间的延长，成牙骨质细胞分化的标志物ALP、Runx2、BSP、OCN、Col1a和CAP mRNA的相对表达量逐渐增加。空白组、阴性对照组和microRNA-214沉默载体组感染成牙骨质细胞系比率达到90%以上。相对于空白组和阴性对照组，microRNA-214沉默组microRNA-214的表达量显著下降，这表明microRNA-214沉默载体很好地发挥了沉默功能。相对于空白组和阴性对照组，microRNA-214沉默组能显著提高成牙骨质细胞的增殖速率。成牙骨质细胞矿化程度的检测发现，相对于空白组和阴性对照组，microRNA-214沉默组矿化结节数量增多，形态变大。同时，成牙骨质细胞分化的标志物ALP、Runx2、OCN、Col1a、BSP和CAP的表达量在microRNA-214沉默组中均显著增加。结论:microRNA-214沉默能够促进成牙骨质细胞分化。

microRNA-214；慢病毒属；牙骨质；细胞分化；牙再矿化

牙周病是人群中最广泛流行的慢性感染性疾病。根据世界卫生组织口腔健康流行病学调查，成年人中约80%患有不同程度的牙周疾病，并已威胁到各个年龄人群，是成年人失牙的首要原因[1]。牙周病对人类的健康危害如此之大，是因为它会引起牙龈和牙周膜胶原纤维进行性溶解破坏以及牙骨质和牙槽骨的吸收缺陷。牙周再生治疗的目的就是重建牙周组织。但牙周再生非常困难，是行内公认的难题，目前世界各国的口腔科研工作者都致力于开发有效促进牙周再生的治疗手段[2]。实际上，牙周组织再生的关键步骤就是牙周连接纤维重新附着于病变的根面上，研究表明，成功的牙骨质再生是牙周组织再生中至关重要的一环[3]。

利用组织工程的方法达到成功的牙周组织再生是目前最为可行并具有可预见性的办法，在牙周组织的再生中起重要作用。成功的牙周组织工程要求具备如下条件:合适的干细胞或前体细胞形成牙周组织，细胞接种到理想的支架材料，合适的因子来介导细胞的多功能分化[4-5]。microRNA-214是一种具有骨改建作用的重要调节因子，研究表明其可以通过Atf4来抑制成骨细胞活性并减少其矿化的能力，这提示microRNA-214可能可以作为一种较为合适的调节因子参与到牙周组织工程中来促进牙骨质的再生[6]，然而microRNA-214在牙骨质分化及矿化中的作用目前缺少相关研究。相对于脂质体、聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）和腺病毒转染，慢病毒载体转染具有包装周期短和长期稳定转染的特点，因此我们将慢病毒作为microRNA-214转染的载体，研究其对成牙骨质细胞分化的影响[7]。

1 材料和方法

1.1 细胞株及主要材料 成牙骨质细胞系购于美国ATCC细胞库；10%胎牛血清购于美国Gibco公司；β-甘油磷酸钠购于美国Sigma公司；microRNA-214沉默慢病毒载体购于上海吉玛基因化学技术有限公司；细胞增殖速率测定试剂盒CCK8购于日本同仁公司；茜素红试剂盒和Von kossa试剂盒购于美国Sigma公司；胰酶、DMEM高糖培养基购于美国Hyclone公司；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、Runt相关基因2（Runtrelated transcription factor 2，Runx2）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、一型胶原（Collagen I，Colla）、核衣壳蛋白（capsule associated protein，CAP）和内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的Real-time反应序列均由北京天一辉远公司设计并合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组:采用含有10%胎牛血清和2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM高糖培养基培养成牙本质细胞系。实验分为3组:空白组为在感染空载体的同时置于正常的细胞培养基中培养；阴性对照组为在感染含有无义序列的病毒上清的同时，置于正常的细胞培养基中培养；microRNA-214沉默组为在感染microRNA-214沉默慢病毒载体的同时，置于正常的细胞培养基中培养。为平衡各组的病毒梯度，分组前采用慢病毒滴度测定试剂盒测量了病毒滴度。成牙骨质向诱导的方法为:在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中加入5 mmol/L β-甘油磷酸钠作为其成牙骨质向分化的诱导剂[8]。

1.2.2 慢病毒感染及鉴定:取对数生长期的成牙骨质细胞，加入含有microRNA-214和阴性对照组的慢病毒载体上清，感染24 h后，分别用倒置荧光显微镜检测平均荧光强度。

1.2.3 细胞增殖速率测定:取病毒感染后对数生长期的成牙骨质细胞，分别用细胞速率测定试剂盒CCK8测定不同组细胞的增殖速率。

1.2.4 茜素红和Von kossa染色:分别将空白组、阴性对照组和microRNA-214沉默组病毒上清感染成牙骨质细胞后，利用成牙骨质细胞分化诱导剂诱导成牙骨质之后，分别采用0.2%的茜素红试剂盒和5% Von kossa染色试剂盒检测成牙骨质细胞形成矿化结节的能力。

1.2.5 Real-time PCR检测:分别提取空白组、阴性对照组和microRNA-214沉默组3组成牙骨质细胞诱导14 d后的总RNA，反转成cDNA后，分别检测Runx2、BSP、ALP、OCN、Col1a和CAP基因的表达水平，并测定诱导14 d后microRNA-214表达情况。1.3 统计学处理方法 采用SPSS14.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，多个时间点之间的比较采用重复测量资料的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成牙骨质细胞矿化诱导 Real-time PCR的结果显示，随着诱导时间的延长，成牙骨质细胞分化的标志物ALP、Runx2、BSP、OCN、Col1a和CAP的表达水平逐渐上升（P＜0.05），表明成牙骨质细胞矿化诱导成功。同期检测了microRNA-214的表达量，发现microRNA-214的表达量随着时间的推移逐渐下降（P＜0.05），见表2。

2.2 microRNA-214沉默慢病毒转染 倒置荧光显微镜下观察发现，空白组、阴性对照组和microRNA-214沉默组均很好地感染上了成牙骨质细胞系，通过计数荧光视野和白场视野的细胞数目，发现感染比率达到了90%以上，表明3组质粒均能顺利地转染进入细胞（见图1）。同时，我们检测了microRNA-214的表达量，发现在空白组和阴性对照组均有较多的microRNA-214的表达量，而在microRNA-214沉默组，其表达量显著下降（P＜0.05），这表明microRNA-214沉默载体很好地发挥了沉默功能（见图2）。进一步检测了3组不同的病毒感染成牙骨质细胞后成牙骨质细胞的增殖速率，发现相对于空白组和阴性对照组，microRNA-214沉默组能够显著提高成牙骨质细胞的增殖速率（见图2）。

表1 成牙骨质细胞矿化诱导过程中Runx2、Bsp、Alp、Ocn、Colla、CAP和microRNA-214的表达量变化（n=6，±s）

表1 成牙骨质细胞矿化诱导过程中Runx2、Bsp、Alp、Ocn、Colla、CAP和microRNA-214的表达量变化（n=6，±s）

图1 慢病毒感染成牙骨质细胞的荧光图（×20）

图2 3组microRNA-214的相对表达量和成牙骨质细胞的增殖量

2.3 microRNA-214沉默载体能够促进成牙骨质细胞的分化及矿化 采用茜素红染色和Von kossa染色来检测成牙骨质细胞矿化的程度，并采用检测成牙骨质细胞分化标志物的方式来检测其分化程度。结果发现，在空白组和阴性对照组中，形成了数量相当的矿化结节，2组间差异无统计学意义。而在microRNA-214沉默组中，发现了矿化结节数量增多，形态变大，见图3。同时，成牙骨质细胞分化的标志物ALP、Runx2、OCN、Col1a、BSP和CAP的表达量在microRNA-214沉默组中均显著增加（P＜0.05），见图4。这些都表明了microRNA-214沉默能够显著地促进成牙骨质细胞的分化和矿化。

图3 茜素红和Von kossa染色检测成牙骨质细胞矿化的程度（×20）

图4 成牙骨质细胞分化的标志物ALP、BSP、Runx2、Col1a、OCN和CAP的mRNA相对表达量

3 讨论

牙周炎是一种非常常见的感染性疾病，极易导致牙齿的缺失。目前大家一直尝试用各种再生性手术、组织工程方法、局部使用重组生长因子等方法促进牙周组织再生，特别是牙周膜和牙槽骨的再生，往往忽略了根面的牙骨质的再生。到目前为止还没有一种方法能够达到重建新的牙骨质、牙周膜和牙槽骨[9]。研究表明成功的牙骨质再生是牙周组织再生的金标准[10]。因此，如何利用组织工程的方法重建功能性的牙骨质具有十分重要的临床意义。

microRNA-214是一种重要的血管生成信号调节因子，在缺氧环境下，上调microRNA-214可以促进血管重构[11]。此外，microRNA-214还是十分关键的骨改建调节因子，其可以通过直接靶点转录因子Atf4来抑制成骨细胞的分化和基质矿化。

本研究发现microRNA-214可以有效地提高成牙骨质细胞增殖速率，Real-time PCR的结果显示，随着诱导时间的延长，成牙骨质细胞分化的标志物ALP、Runx2、BSP、OCN、Col1a和CAP的mRNA相对表达量逐渐增加。李瑶等[12]和童晓洁等[13]研究表明，ALP、Runx2、BSP、OCN、Col1a和CAP是在成骨细胞分化及牙齿的发育过程中起着重要作用的转录因子，牙齿及骨组织中的特异性基质蛋白在转录水平均受其调控。空白组、阴性对照组和microRNA-214沉默组感染成牙骨质细胞系比率达到90%以上。相对于空白组和阴性对照组，microRNA-214沉默组microRNA-214的表达量显著下降，这表明microRNA-214沉默载体很好地发挥了沉默功能。成牙骨质细胞矿化的程度检测发现，相对于空白组和阴性对照组，microRNA-214沉默组矿化结节数量增多，形态变大。杨楠等[14]研究发现，microRNA-21的靶基因负向调控人骨髓间充质干细胞的成骨分化，在骨形成过程发挥着重要作用，与本文研究结果相似，microRNA能够促进骨质细胞矿化。同时，成牙骨质细胞分化的标志物ALP、Runx2、OCN、Col1a、BSP和CAP的表达量在microRNA-214沉默组中均显著增加。这表明，microRNA-214影响成牙骨质细胞分化及矿化的机制可能与其在骨改建中的机制相同，即通过结合Atf4的mRNA，抑制Atf4的表达，从而抑制了成牙骨质细胞的分化及矿化。李春雷等[15]研究发现，在人牙周膜细胞骨向分化中microRNA101可能通过抑制PLAP-1而促进其成骨分化能力，与本研究结论一致。

综上所述，microRNA-214沉默可以显著促进成牙骨质细胞的增殖、分化、矿化，可能作为一个潜在的靶点应用于牙周组织工程。

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（本文编辑：贾建敏）

The functional role of microRNA-214 in the differentiation and mineralization of cementoblasts

SUN Fucai1, LIU Xueting1, CAI Zhibin2, ZHANG Jinhua1.
1.Department of Stomatology, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of General Dentistry, the Aff liated Stomatological Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To construct a silencing plasmid of microRNA-214 and study the functional role of microRNA-214 in the differentiation and mineralization of cementoblasts.Methods:The cementoblasts was cultured in normal condition and expression level of the cementoblastic markers was test during the differentiation and mineralization induction period. Silencing lentiviral vector of microRNA-214 was constructed and then transfected into mouse cementoblasts (OCCM-30 cell lines). Fluorescence microscope was used to detect transfection ability and silencing effects of the construct. Alizarin Red and Von kossa staining was used to test the mineralization ability of cementoblasts. Real-time PCR was used to demonstrate the differentiation ability of cementoblasts.Results:Real-time PCR results showed that the relative expression of cementoblast differentiation marker ALP, Runx2, BSP, OCN, Col1a and CAP mRNA increased gradually as time goes on. The blank group, negative control group and microRNA-214 group infection ratio of silent carrier reached more than 90% cementum cells. Compared with blank group and negative control group, the expression of microRNA-214 in the microRNA-214 silencing group decreased 5 times. The results showed that the microRNA-214 silencing vector played a good role in silence. Compared with blank group and negative control group, microRNA-214 silencing group could signif -cantly increase the proliferation rate of cementoblasts. Compared with blank group and negative control group, microRNA-214 silencing group, the number of mineralized nodules increased and the morphology becamed larger. Cementoblast differentiation markers ALP, Runx2, OCN, Col1a, BSP and CAP expression were significantly increased in microRNA-214 silencing group in silence.Conclusion:The research demonstrats that silencing lentiviral vector of MicroRNA-214 can promote the differentiation and mineralization ability of cementoblasts.

microRNA-214; lentivirus; dental cementum; cell differentiation; tooth remineralization

R780.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.007

2016-07-24

孙福财（1976-），男，浙江温州人，主治医师，硕士。