碱性果胶酶高产菌株的构建和高密度发酵

望潇文，向腊，徐婷，卢争辉，张桂敏

湖北大学生命科学学院 生物资源绿色转化湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430062

苎麻纤维不仅是纤维中最长、最坚韧和最丝滑的，还具有润湿性好、不易缩水、易印染和可以抵抗霉菌、细菌及昆虫等优良的特性[1]，因此被普遍应用于纺织和造纸行业中。然而，苎麻纤维中含有20%−30%由果胶和半纤维素组成的胶质，当其应用于工业生产时，这些胶质必须被去除[2]。在传统的化学脱胶中，由于大量碱的使用和能量的消耗，引起了严重的环境污染，需要使用大量的人力物力来处理废水、废气[3]。因此，利用微生物或其酶类来进行生物脱胶成为一种研究趋势[4]。另外，棉织物前处理中的煮练是去除棉织物表面大部分天然杂质如果胶质、蜡质和残留的浆料，从而改进织物的外观，提高润湿性，以利于印染等后加工。传统工艺是在高温强碱条件下去除纤维素共生物，除了对环境污染严重外，对纤维的损伤大，失重大。碱性果胶酶作为一种天然蛋白质易于生物降解，不会污染环境与纺织品，具有保护纤维、提高精炼效率、降低能耗和污染等优势[5]。

果胶酶可以催化水解果胶分子中的α-1,4糖苷键，将其分解为半乳糖醛酸等物质[6]。果胶酶可以从多种微生物中分离得到，比如芽孢杆菌[7]、链霉菌[8]和放线菌[9]等。碱性果胶酶主要是由芽孢杆菌产生，然而芽孢杆菌会分泌出对纤维有害的内源性纤维素酶，因此在工业生产中芽孢杆菌并不是一个非常适合分泌表达碱性果胶酶的宿主。而毕赤酵母Pichia pastoris作为外源蛋白表达系统一直被广泛应用[10]，它不产生内源纤维素酶，具有醇氧化酶 (AOX1) 强启动子，可以严格调控外源蛋白的表达，且表达的蛋白还可以被糖基化从而提高蛋白的热稳定性，以甲醇作为诱导物，生产成本较低，非常适合工业化大规模生产。以最典型的分泌型表达载体pPIC9K为例，它具有醇氧化酶基因 5ʹAOX1启动子、3ʹAOX1终止子，能胞外分泌表达的信号肽序列MFα，并以HIS4基因重组互补作为选择标记[11]。

本研究前期将来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis中的碱性果胶酶基因pel168首先在大肠杆菌里表达[12]，测定了其所产碱性果胶酶 PEL168E最适温度为 55 ℃，最适 pH为 9.5，比酶活为353 U/mg，然后将pel168进行密码优化后，利用载体pHBM905A在毕赤酵母GS115中进行表达得到 PEL168P，其最适反应条件和比酶活与PEL168E保持一致，但是发生了糖基化，在60 ℃的热稳定性显著高于 PEL168E，说明糖基化可以提高该酶的热稳定性。pHBM905A是在pPIC9K的基础上把卡那霉素Kan抗性基因表达盒插入到多克隆位点并在其上下游加上限制酶CpoⅠ和NotⅠ识别位点，并且将元件“Ampr+Ori”插入到HIS4基因序列中得到[13]。将该碱性果胶酶用于苎麻脱胶，发现其可以有效地去除苎麻纤维表面的果胶，但是构建的工程菌所表达的酶活仅为54 U/mL，导致应用成本过高。

本研究中用的表达载体 pHBM905BDM 是在pHBM905A 的基础上将 5ʹAOX1启动子替换成d1+2×201AOX1，信号肽由MFα替换成MF4I-SS[14]。三种载体pPIC9K、pHBM905BDM和pHBM905A都是穿梭质粒，所不同的是，pPIC9K含有组氨醇脱氢酶基因 (HIS4) 筛选标记和G418抗性筛选标记；另外两个只含有HIS4筛选标记。本研究先构建了重组质粒pHBM905A-pels和pHBM905BDM-pels，检测载体上启动子和信号肽的不同对蛋白表达量的影响；然后利用pHBM905BDM上的HIS4筛选标记，将 pHBM905BDM-pels电转化 GS115酵母感受态，得到的转化子通过果胶底物平板功能筛选获得碱性果胶酶多拷贝菌株。同时构建重组质粒 pPIC9K-pels，电转化通过功能筛选得到的酵母多拷贝菌株，并利用G418筛选重组子，以期得到表达量更高的菌株，从而进一步降低碱性果胶酶的生产成本。最后将得到的高产菌株进行高密度发酵，检测其在小型发酵罐中的产酶水平。

1　材料与方法

1.1　材料与配方

菌株：大肠杆菌Escherichia coliXL10-Gold克隆菌株、大肠杆菌Rossset Blue(DE3) 表达菌株购自 Transgene公司，毕赤酵母 GS115购自Invitrogen公司。

质粒：pPIC9K购自 Invitrogen公司，pHBM905A[13]、pHBM905BDM[14]均为本实验室改造。

培养基：

YPD：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，1.5%琼脂 (固体)。

LB：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，0.5%NaCl，1.5%琼脂 (固体)。

BMGY：1%酵母提取物，2%蛋白胨，0.34%YNB，1% (NH4)2SO4，100 mmol/L磷酸钾缓冲液 (pH 6.0)，1%甘油。

BMMY：同BMGY，无甘油。

MD：0.34% YNB，1% (NH4)2SO4，2%葡萄糖，1.5%琼脂 (固体)。

果胶底物培养基：1%果胶，1.5%琼脂，其余同BMMY，pH 7.0。

甘油分批发酵培养基：甘油40 g/L，K2SO418 g/L，KOH 4.13 g/L，MgSO4·7H2O 14.9 g/L，85% H3PO427 mL/L，CaSO40.93 g/L，微量元素溶液(PTM1) 4 mL/L[15]。

生长补料培养基：含12 mL/L PTM1的50%(V/V) 的甘油溶液。

诱导补料培养基：含12 mL/L PTM1的100%的甲醇溶液 (分析纯)。

1.2　毕赤酵母表达载体的构建

将来源于Bacillus subtilis168的碱性果胶酶基因pel根据毕赤酵母密码子偏爱性进行优化后得到基因pels，以引物F-P1和R-P1 (表1) 得到目的基因 PCR产物，经琼脂糖凝胶回收后用T4DNA聚合酶和dTTP在12 ℃处理20 min，得到两端分别是CpoⅠ和NotⅠ的粘性末端，处理好的基因片段pels分别与经双酶切的载体pHBM905A和pHBM905BDM连接，连接产物转化大肠杆菌XL10-Gold得到的正确重组质粒分别命名为pHBM905A-pels和 pHBM905BDM-pels。由引物F-P2和R-P2 (表1) 得到的目的基因和表达载体pPIC9K同时用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行酶切，处理好的基因片段与载体酶连，连接产物转化大肠杆菌 XL10-Gold得到的正确重组质粒命名为pPIC9K-pels。

1.3　毕赤酵母的电转化

将线性化的重组质粒电转化毕赤酵母 GS115感受态细胞，电转条件为：电压 1.5 kV，电击时间4 ms。电击后，立即加入1 mL冰预冷的1 mol/L山梨醇溶液，用移液器轻柔吸打混匀后，涂布于MD平板上，28 ℃培养直至转化子出现。

1.4　平板筛选高拷贝菌株

1.4.1　果胶底物平板

当插入到毕赤酵母基因组上的异源基因拷贝数越多，则表达量应该越高，因此对应的碱性果胶酶的酶活越高。将MD平板上的转化子接种于果胶底物平板上28 ℃培养，每隔12 h加适量的甲醇于平板盖上进行诱导。2–3 d后，在平板表面覆盖一层 1%的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 溶液并静置 10 min左右观察水解圈的形成，水解圈越大代表对应菌株产酶能力越强。

1.4.2　G418抗生素平板

将电转后的产物涂布于含0.5 mg/mL G418的MD平板上，待转化子长出后将其逐步接种于含1、2、3和4 mg/mL G418的YPD平板上，观察酵母菌株的生长状态，理论上生长越快越好的菌株含有目的基因拷贝数越高，从而产酶量越高。

1.5　碱性果胶酶在毕赤酵母里的诱导表达和酶活测定

测定方法参考文献[12]。

1.6　qPCR测定转录水平对蛋白表达的影响

RNA提取的方法参照TRIzol®Reagent kit，根据 RNA (mg/mL)=40×OD260×稀释倍数来计算RNA的量，取相同量的RNA进行反转录为cDNA的第一条链。反转录的方法参照 TaKaRa PrimeScriptTM1st strand kit。相对定量PCR的方法参照TaKaRa SYBR®Green I kit。进行相对基因表达分析一般采用的是操作简便的2–ΔΔCt法，内参基因选用的是 GS115内源的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因GAP，但是目的基因和内参基因扩增效率都必须接近100%，并且相互之间的效率偏差也必须在5%以内。

表1　文中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.7　qPCR检测目的基因的拷贝数

1.7.1　毕赤酵母总DNA的抽提

总 DNA抽提的方法参照 Easy-DNA™ kit(Invitrogen)，测定总 DNA的浓度及纯度，当A260/A280高于1.8时可用于下一步的分析。

1.7.2　绝对定量

1) 标准曲线的建立

以毕赤酵母 GS115菌株的基因组为模板，F-P3和 R-P3为引物 (表 1)，PCR扩增GAP基因；以pHBM905A-pels为模板，F-P1和R-P1 (表1) 为引物，PCR扩增pels基因。回收纯化的GAP和pels片段分别与pMD18-T连接，转化大肠杆菌感受态，得到正确的重组质粒 pMD18T-GAP和pMD18T-pels，测定浓度并根据质粒的质量分数和阿伏伽德罗常数[16-17]，利用如下公式计算出每微升质粒溶液中所含质粒的拷贝数。

将质粒溶液稀释成 104、105、106、107、108个拷贝/μL的DNA溶液，分别以1 μL各浓度质粒溶液作为模板，以引物F-P4/R-P4和 F-P5/R-P5(表1) 进行荧光定量PCR。以实时荧光定量PCR仪自带软件给出的Ct值作为纵坐标，模板中质粒拷贝数的对数值作为横坐标，建立标准曲线。PCR的效率由标准曲线的斜率计算出，公式为E=10–1/slope–1。

2)pels基因拷贝数的测定

以含有pels基因的毕赤酵母菌株基因组DNA为模板，分别用引物F-P4/R-P4和F-P5/R-P5 (表1) 进行荧光定量PCR。将得到的Ct值分别代入标准曲线中，求出 DNA样品中GAP基因和pels基因的起始模板拷贝数。GAP基因在毕赤酵母的基因组中以单拷贝的形式存在，因此可以用GAP基因的拷贝数表征模板中基因组的起始拷贝数。pels基因起始模板拷贝数与GAP基因起始模板拷贝数的比值即为pels基因在毕赤酵母基因组中的拷贝数。

1.8　高密度发酵

将高产菌株接种于100 mL YPD 培养基中，28 ℃、200 r/min摇床培养24 h，至OD600为20左右。将种子培养液按10%接种量接入5 L发酵罐中，初始培养条件为：装料量2 L，搅拌转速为500 r/min，通气量为4 vvm。生长阶段温度为28 ℃，采用流加25%的浓氨水控制pH为5.5。当甘油耗尽时 (DO迅速上升至60%以上)，采用与溶氧偶联方式使 DO维持在 (30±5)%并补加50% (V/V) 的甘油。当OD600为300左右时，停止流加甘油，待甘油再次耗尽 (DO迅速上升至60%以上)，开始流加甲醇进行诱导表达，并将培养温度降低至25 ℃，同样采用与溶氧偶联方式流加。每12 h取样测定碱性果胶酶酶活。

2　结果与分析

2.1　不同表达载体对果胶酶酵母表达的影响

表达载体 pHBM905BDM 具有比 pHBM905A更好的启动子和信号肽，因此用pHBM905BDM载体的菌株分泌表达产物的能力理论上应该更强。挑取了在底物平板上水解圈最小的毕赤酵母重组菌株 GS115-pHBM905A-pels和 GS115-pHBM905BDM-pels同时进行摇瓶诱导发酵，每隔24 h取样测定酶活。结果 (图1) 发现诱导第3天时，含两种载体的菌株所产的酶活同时达到最高，利用载体pHBM905A表达的碱性果胶酶酶活为68 U/mL，利用载体pHBM905BDM的酶活为100 U/mL，提高了47%。

2.2　qPCR从转录水平分析两种载体的表达

由于 pHBM905BDM 表达载体具有更强的启动子和胞外分泌的信号肽，为了研究启动子的优化对PEL168S的表达影响，通过qPCR来从转录水平上分析蛋白的表达。抽提两种菌株GS115-pHBM905A-pels和GS115-pHBM905BDM-pels的总RNA，进行反转录得到cDNA，再进行qPCR，根据相对定量 2–ΔΔCt法进行相对基因表达分析。结果表明 (图2)，利用pHBM905BDM表达的碱性果胶酶的 mRNA表达水平比用pHBM905A的提高了 27%。由于胞外表达酶活提高了47%，因此推测pHBM905BDM上的信号肽对碱性果胶酶 PEL168S的表达促进程度比pHBM905A要高约20%。

图1　两种载体表达碱性果胶酶的摇瓶表达酶活Fig. 1 The comparison of enzyme activities expressed by two different vectors.

2.3　果胶底物平板筛选高拷贝菌株

由于当pels基因利用载体 pHBM905BDM在毕赤酵母里的表达量更好，因此选用重组质粒pHBM905BDM-pels来进行后面的工作，该质粒经SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母GS115，将得到的转化子点在果胶底物平板上，如图 3所示，将筛选出的最大水解圈对应菌株命名为 GS115-pHBM905BDM-pels4，经摇瓶发酵检测该菌株所产的碱性果胶酶酶活提高至536 U/mL。

图2　两种载体表达碱性果胶酶mRNA表达水平比较Fig. 2 The comparison of the mRNA transcription levels of alkaline pectate lyase based on the vectors pHBM905A and pHBM905BDM.

图3　果胶底物平板筛选转化子Fig. 3 Screening of the transformants with the activity of pectate lyase on the plate containing pectin. (A) The size of transformants as control. (B) The halo formation.C: GS115 as negative control.

2.4　G418抗性筛选高拷贝菌株

将 2.3中筛选出的高拷贝菌株 GS115-pHBM905BDM-pels4制作成感受态，导入经SacⅠ线性化的重组质粒 pPIC9K-pels，转化产物涂布于含0.5 mg/mL G418的MD平板上，然后将长出的转化子点在G418浓度逐渐提高的YPD平板上，于28 ℃培养5–8 d并经常观察转化子的生长状况。最终当G418的浓度提高至4 mg/mL，如图4所示筛选得到一株生长最好的转化子，命名为GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1，经摇瓶发酵检测，该菌株所产碱性果胶酶酶活提高至770 U/mL。

图4　抗生素G418筛选转化子Fig. 4 Screening of the transformants on the plate with the antibiotics G418. (A) The initial size of transformants as control. (B) The size of transformants after 6 days. C: GS115-pHBM905BDM-pels as negative control.

2.5　qPCR检测毕赤酵母基因组中目的基因拷贝数

将含有pels基因的毕赤酵母基因组同样进行real-time PCR反应，通过标准曲线计算出pels基因在毕赤酵母基因组中的拷贝数。毕赤酵母GAP基因Ct值与起始拷贝数对数值的回归方程为：y=–3.5262x+42.204，PCR 效率为 1.744，pels基因Ct值与起始拷贝数对数值的回归方程为：y=–3.5039x+42.179，PCR效率为1.738，可以看出做出标准曲线的两个 PCR效率几乎是一致的。由表 2里的Ct值经计算得菌株 GS115-pHBM905BDM-pels4中pels的拷贝数为5，菌株GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1中pels的拷贝数为7。

2.6　高密度发酵

由于菌株 GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1的表达量最高，将其进行高密度发酵使碱性果胶酶的表达量进一步提高。发酵诱导周期为120 h左右，每 12 h取样测菌体干重和上清酶活，结果如图 5所示。当诱导到 96 h时，酶活达到最大值2271 U/mL，约为摇瓶发酵所得碱性果胶酶酶活的 3倍，但是未达到预期的目标。同时用SDS-PAGE检测诱导期间每12 h取得的上清液，发现108 h时的样品目的条带变小了，推测目的蛋白可能被降解。为了分析发生降解的原因，通过网站 (https://prosper.erc.monash.edu.au/) 预测分析发现该碱性果胶酶的氨基酸序列中存在毕赤酵母GS115的内源蛋白酶Prb1的酶切位点。另外由图 6第 5、6泳道可以看出诱导 96 h和108 h的样品多出一条带，且浓度呈现增高趋势，将该蛋白带 (黑框表示) 进行质谱检测发现是醇氧化酶AOX1，由于AOX1是胞内酶，说明在诱导过程中酵母细胞出现死亡裂解的现象，从而导致内源蛋白酶的释放降解了部分目的蛋白，酶活未达到预期目标。

表2　qPCR测定目的基因拷贝数的Ct值和拷贝数Table 2 The Ct values and copy numbers of two strains measured through qPCR

图5　高表达果胶酶毕赤酵母的高密度发酵Fig. 5 High-density fermentation of P. pastoris with high yield pectate lyase.

图6　SDS-PAGE检测发酵上清Fig. 6 SDS-PAGE measurement of fermentation supernatant. 1: 48 h; 2: 60 h; 3: 72 h; 4: 84 h; 5: 96 h; 6:108 h; M: marker.

3　讨论

本研究构建了重组质粒pHBM905A-pels和pHBM905BDM-pels，其中pHBM905BDM-pels具有更强的启动子与信号肽，实验验证 pHBM905BDM分泌表达目的蛋白的能力的确更强，因此选用该载体表达目的基因。然后利用HIS4选择标记，将pHBM905BDM-pels电转化毕赤酵母GS115，并通过果胶底物平板功能性筛选得到整合了多拷贝果胶酶基因pels的菌株。在此基础上，将pPIC9K-pels电转化上述菌株制备的感受态细胞，利用G418筛选和摇瓶发酵成功得到了产量进一步提高的高产菌株。本研究的结果证实了利用HIS4营养缺陷型和G418抗性的双选法筛选碱性果胶酶高产工程菌是可行的，利用这个策略，果胶酶的产量从68 U/mL提高至770 U/mL，提高了10倍多，为定向获得多拷贝整合的酵母高产菌株提供了新的思路。

近十几年来，来源于欧文氏菌Erwinia[18]、放线菌Actinomycetes[9]和芽孢杆菌Bacillus[19]等的碱性果胶酶基因已通过基因工程技术得到了表达，这些表达主要以E.coli为表达宿主，IPTG作为诱导剂，表达产量较低且大多属于内分泌型，考虑到IPTG和破菌的成本，限制了其在工业上的应用。本研究采用的是真核表达系统——巴斯德毕赤酵母，除了具有细胞生长快、易于培养、遗传操作简单等特点外，还可以对表达的蛋白质进行正确加工、修饰和分泌等。毕赤酵母已基本成为较完善的外源基因表达系统，其优势有：含有特有的醇氧化酶启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；易于高密度发酵，以更廉价的甲醇代替IPTG作为诱导物，生产成本较低，细胞干重可以很快达到很高的浓度 (120 g/L以上)，利于工业化生产；外源基因通过整合型质粒整合于毕赤酵母染色体基因组上，结构稳定；能使产物有效分泌并适当糖基化，自身分泌的蛋白质非常少，便于产物纯化[20]。毕赤酵母已广泛作为宿主菌株成功表达了很多外源重组蛋白，例如应用于工业上的木聚糖酶 (178 mg/L)[21]、纤维素酶(65 mg/L)[22]、脂肪酶 (630 mg/L)[23]和植酸酶(63 mg/L)[24]等；用毕赤酵母生产用于生物医药上的蛋白时，所产的蛋白效价高且没有细菌内毒素或潜在的病毒污染，例如可用于生产胰岛素前体 (1.5 g/L)[25]、人血清白蛋白 (6 g/L)[26]和肿瘤坏死因子 (10 g/L)[27]等，通过不断优化表达载体上的信号肽和启动子，外源蛋白的表达量可进一步提高[28]。

然而，在毕赤酵母里表达的碱性果胶酶并不多，且表达量也较低。最早表达的是来源于真核生物腐皮镰孢霉Fusarium solanif. sp.pisi[29]中的pelB和pelC，近几年研究较多的是来源于Bacillus subtilisWSHB04-02的碱性果胶酶在GS115中的表达[30]，并经过一系列发酵优化策略，例如调节甲醇和菌体浓度比率[31]、表达阶段采用低温[32]、在菌体生长阶段采用甘油指数流加、在诱导阶段采用甲醇分阶段流加和山梨醇与甲醇混合添加诱导[15]等方法，使得PGL的产量最高为1593 U/mL。本研究中筛选得到的碱性果胶酶高产菌株在 5 L发酵罐中的表达水平达到了2271 U/mL，虽然未达到预期目标，但已经是目前文献报道的最高表达水平。P. pastoris在以甲醇作为唯一碳源和能源表达外源目的蛋白时，细胞生长与蛋白表达一直存在着激烈的竞争，共同争夺碳源和能源，也导致外源蛋白表达效率降低。虽然有报道碱性果胶酶PL在大肠杆菌BL21(DE3) 中分泌表达[33]，用IPTG诱导的发酵上清酶活可达到4507 U/mL。但考虑到毕赤酵母表达所用诱导剂的成本远远低于 IPTG，且相比于大肠杆菌其自身分泌蛋白更少，产物方便纯化，通过一系列发酵策略的优化[34]，有望进一步提高该菌株的发酵产量，使其更加具有应用于纺织行业的潜力。

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