恩诺沙星及代谢物在西伯利亚鲟疾病模型内的药动学及残留消除规律

赵 凤,周 洲,*,李小义,孔 杰,杨秋红,刘永涛

(1.贵州省水产研究所,贵州贵阳 550025;2.中国水产科学研究院长江水产研究所农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心,湖北武汉 430223)

恩诺沙星及代谢物在西伯利亚鲟疾病模型内的药动学及残留消除规律

赵 凤1,周 洲1,*,李小义1,孔 杰1,杨秋红2,刘永涛2

(1.贵州省水产研究所,贵州贵阳 550025;2.中国水产科学研究院长江水产研究所农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心,湖北武汉 430223)

采用高效液相色谱法,研究了20 ℃条件下人工感染嗜水气单胞菌的西伯利亚鲟口灌恩诺沙星(剂量10 mg/kg)后,其血液中药代动力学规律,采用药代动力学软件3p97对药物浓度时间数据进行分析。结果表明,恩诺沙星及代谢物环丙沙星在感染嗜水气单胞菌的西伯利亚鲟体内的药时量曲线关系符合二室模型,达峰时间Tmax分别为0.37 h和1.12 h;峰浓度值Cmax分别为0.329和0.164 mg/L;表观分布容积Vd分别为40.12和49.239 L/kg,吸收半衰期T(1/2)α分别为5.732和8.17 h;消除半衰期T(1/2)β分别为45.131和40.521 h。与健康西伯利亚鲟相比,恩诺沙星及代谢物在受感染的西伯利亚鲟体内,吸收相对缓慢,消除也慢。恩诺沙星在疾病模型西伯利亚鲟肝脏和肌肉中的消除方程分别为:C=0.13e-0.005t,C=2.31e-0.006t;R2≥0.825;环丙沙星在疾病模型西伯利亚鲟肝脏和肌肉中的的消除方程分别为:C=4.412e-0.007t;C=4.915e-0.004t;R2≥0.758。

恩诺沙星,西伯利亚鲟,疾病模型,药动学

鲟鱼是一种珍贵的稀有鱼,具有重要的经济价值和药用价值。近年来,随着养殖规模的扩大,由于高密度养殖、投喂率增加、消毒剂和药物滥用以及不适当的管理方法等,使得养殖环境日益恶化,病害频繁发生且日趋严重,尤其是由气单胞菌属细菌引起的鲟鱼气单胞菌病危害最为严重,每年给养殖从业者带来极大的经济损失,严重阻碍鲟鱼养殖业的健康发展。

恩诺沙星(enrofloxacin,EF)作为动物专用的喹诺酮类抗菌药物,已广泛用于水产养殖动物感染性疾病的预防和治疗[1]对鲟鱼气单胞菌有很好的治疗作用,但长期使用后,药物残留问题也越来越突出[2]。国内外关于恩诺沙星在健康水产动物体内的药动学研究很多,然而在患病鲟鱼体内的药动学还未见报道。疾病会导致动物的机体发生变化,影响药物的吸收代谢[3],因此研究患病状态下的药动学可以更好的为水产动物合理用药提供科学依据[4]。本实验以在建立的人工感染嗜水气单胞菌的西伯利亚鲟模型下,研究了疾病模型下的药动学及残留消除规律,阐明了健康与感染的动物的药动学差异,为合理用药提供更好的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗜水气单胞菌(A.hydrophila) 中国普通微生物菌种保藏管理中心;西伯利亚鲟 由贵州省水产研究所惠水基地提供,平均体重为(40±10) g,实验前在水族箱内(60 cm×80 cm×40 cm)暂养一周,实验用水为曝气48 h自来水,连续充氧,保持水中溶氧大于6.0 mg/L,温度为20 ℃;乙腈、正己烷、质谱水 美国CNW公司,色谱纯;无水硫酸钠、磷酸、三乙胺 国药集团化学有限公司,分析纯;恩诺沙星标准品、环丙沙星标准品 Dr. Ehrenstorfer GmbH,纯度>99.0%;恩诺沙星原粉 浙江国邦药业有限公司,有效成分94%;血液生化指标试剂盒 南京建成生物工程研究所。

高效液相色谱 美国Waters公司;精密电子天平 梅特勒-托利多公司;自动高速冷冻离心机 日本HITACH公司;旋转蒸发仪 德国Heidolph公司;氮吹仪 杭州奥盛仪器有限公司;涡旋混合器 北方同正。

1.2 实验方法

1.2.1 人工感染、实验采样 将嗜水气单胞菌(A.hydrophila)接种于LB平皿培养基上,30 ℃培养18 h后,离心,除去上清液,然后用PBS溶液制成含量为1.5×108～1012cfu/mL的菌悬液备用。实验分为感染组和对照组,感染组设菌液1.5×108、1.5×109、1.5×1010、1.5×1011、1.5×1012cfu/mL五个浓度,每个浓度30条西伯利亚鲟,对照组为30条。采用腹腔注射法,对感染组健康的西伯利亚鲟臀鳍靠腹部注射0.3 mL的菌悬液,对照组注射等量PBS溶液,注射24 h后观察西伯利亚鲟的发病症状及死亡症状,连续观察7 d,如果有死亡的西伯利亚鲟,对其解剖观察并分离和鉴定病原菌类型。实验7 d结束后,分离未发生死亡的各个浓度组的血液的血清,每个浓度随机取5条鱼,采用试剂盒分析各个浓度组的血清总蛋白、白蛋白、谷丙转移酶、谷草转移酶、γ-谷氨酰转移酶等生化指标的变化水平。最佳的感染浓度为可以引起西伯利亚鲟发病但不能致其死亡的菌浓度,取具有典型嗜水气单胞菌症状的西伯利亚鲟进行实验[5-6]。

实验在室内养鱼房进行,每个水族箱放养西伯利亚鲟10尾左右。称取恩诺沙星原粉100 mg,用5%冰醋酸溶解后,定容至100 mL,此时恩诺沙星(EF)含量为1 mg/mL,使用10 mg/kg的剂量口灌给药。在给药0、15、30 min、1、2、4、6、8、10、12、24、48、96、144、192、288 h采集血液、肝脏、肌肉样品。每个时间点取5尾西伯利亚鲟作为平行样,分别取血液、肌肉和肝脏,保存于-20 ℃。

1.2.2 样品处理 准确称取肌肉、肝脏样品1.00 g(血液1.00 mL),依次加入3 g无水硫酸钠和3 mL酸化乙腈,用涡旋仪混匀后,超声5～10 min,8000 r/min离心5 min,去上层清液。往残渣中继续加3 mL酸化乙腈,重复操作,合并上层清液,于55 ℃氮吹仪上氮吹至干。用1.0 mL流动相充分溶解,涡旋并离心后,经0.22 μm微孔过滤膜过滤后,供高效液相色谱仪测定。

1.2.3 标准溶液配制和标准曲线的制备 准确称取0.020 g恩诺沙星和环丙沙星,用乙腈稀释,并定容至100 mL,配制成200 mg/L的标准储备液。配制时使用棕色容量瓶,低温避光储存,有效期为6个月。将恩诺沙星和环丙沙星标准储备液用流动相依次稀释,配制恩诺沙星和环丙沙星浓度为5、10、20、50、100、200、500、1000、2000 ng/mL的标准曲线。采用高效液相色谱荧光检测器分析检测,以峰面积为纵坐标,以药物浓度为横坐标作标准曲线方程。

1.2.4 回收率、精密度和检测限 空白鱼组织加入一定量的恩诺沙星、环丙沙星标准溶液(1 mg/L),放置至少30 min,每个样品同时做7个平行。再按照样品预处理方法进行处理后进样,分别计算组织中恩诺沙星和环丙沙星的含量。空白样品中添加的恩诺沙星和环丙沙星标准液使其最终的质量浓度分别为:1、5、20、100 μg/kg。样品中实际测得的药物浓度与添加的药物浓度的比值为相对回收率。所有样品在一天内5个不同时间点重复测试,连续测试3 d,计算各组织中的恩诺沙星、环丙沙星的日内精密度和日间精密度。以引起3倍基线噪音的药量的质量浓度作为最低检测限。

1.2.5 色谱条件 色谱柱:反相色谱柱C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈∶磷酸三乙胺=15∶85(V/V);流速0.85 mL/min;激发波长280 nm,发射波长450 nm;柱温:40 ℃;进样量:10 μL。

1.3 数据处理

所有数据采用Microsoft Excel 2016进行记录,分析药物浓度与时间的关系,并绘制药时曲线,初步确定药物在体内的代谢过程。使用药动学软件3p97对药动学模型进行拟合并计算相关系数。消除方程采用C=C0e-kt,C表示药物浓度,C0为残留消除对数曲线的截距(μg/kg或ng/mL),k表示消除速率常数。

2 结果与分析

2.1 色谱图及标准曲线

在该条件下,恩诺沙星(20 ng/mL)和环丙沙星(30 ng/mL)保留时间分别为10.21 min和14.32 min。色谱图如图1所示。

图1 恩诺沙星及其代谢物标准色谱图Fig.1 The standard chromatogram of enrofloxacin and its metabolites

恩诺沙星和环丙沙星的标准溶液在5～2000 ng/mL质量浓度(X)与峰面积(Y)的线性回归方程分别为Y=50.21X+0.39,Y=4032X+0.18,相关系数分别为R2=0.9995和R2=0.9999,相关性良好。

表2 西伯利亚鲟的血液生化指标

注:*表示同列数据具有显著性差异(p<0.05)。

表3 组织中的恩诺沙星、环丙沙星的回收率和精密度

2.2 嗜水气单胞菌人工感染浓度的确定

本实验结果显示1.5×1010、1.5×1011、1.5×1012cfu/mL嗜水气单胞菌会不同程度的引起鱼体死亡,见表1,而且作者从死亡鱼体中又分离到了与原攻毒的嗜水气单胞菌菌株。而1.5×108、1.5×109cfu/mL嗜水气单胞菌虽都未引起西伯利亚鲟死亡,但只有1.5×109cfu/mL嗜水气单胞菌感染组引起鱼体血清总蛋白、白蛋白、谷丙转移酶、谷草转移酶、γ-谷氨酰转移酶这些生化指标的显著性变化,见表2。因此,将1.5×109cfu/mL作为人工感染西伯利亚鲟的最佳嗜水气单胞菌浓度。

表1 西伯利亚鲟人工感染嗜水气单胞菌的死亡情况

总蛋白、白蛋白、谷丙转移酶等血液生化指标可以作为衡量机体健康与否的依据。当肝功能受损时,体内白蛋白的含量下降,总蛋白、谷丙转移酶、谷草转移酶、γ-谷氨酰转移酶升高[7-8]。本研究发现,西伯利亚鲟人工感染后,肝功能受损,其中血清总蛋白、谷丙转移酶、谷草转移酶、γ-谷氨酰转移酶含量显著上升,白蛋白的含量显著下降。郭松林[9]等研究了患气单胞病的鱼体的肝肾病变情况,与作者研究结论相同。

2.3 回收率与精密度

各组织中恩诺沙星和环丙沙星的回收率、精密度结果见表3。由表3中可以看出血浆、肝脏、肌肉中恩诺沙星和环丙沙星的回收率大部分在85%以上;恩诺沙星和环丙沙星在血浆、肝脏、肌肉中日内、日间精密度相对标准偏差均小于5%。这说明此实验方法检测恩诺沙星和环丙沙星回收率高而且稳定。各组织中恩诺沙星和环丙沙星的检测限为5.0 μg/kg和1.0 μg/kg。

2.4 恩诺沙星在人工感染细菌性疾病的西伯利亚鲟肝脏和肌肉中的残留消除规律

恩诺沙星以10 mg/kg剂量对人工感染嗜水气单胞菌的西伯利亚鲟口灌给药后,肌肉和肝脏中恩诺沙星浓度随时间的变化关系见图2。给药后,肌肉和肝脏中恩诺沙星的吸收和消除情况大致相同,都是先上升后下降然后出现一个小的波动后,再逐渐平稳。实验数据表明,恩诺沙星在肌肉中第2 h即达最高(Cmax为0.824 mg/kg),在肝脏中第1 h即达到药峰(Cmax为0.941 mg/kg)。数据经处理后,得到肝脏和肌肉中药物浓度与时间关系的消除方程、相关系数及消除半衰期:肝脏C=0.13e-0.005t(R2=0.885),消除半衰期T(1/2)β为300.194 h;肌肉C=2.31e-0.006t(R2=0.825),消除半衰期T(1/2)β为402.987 h;从图2中还可以看出,肝脏和肌肉的药物浓度都比较低,与本文作者已经研究的恩诺沙星在健康的西伯利亚鲟[10]体内的数据相比较,在患病条件下的西伯利亚鲟对药物的吸收和消除变慢。

图2 人工感染条件下口灌给药后组织中恩诺沙星的药时曲线Fig.2 Tissue enrofloxacin concentration-time profile following oral administration

关于恩诺沙星在水产动物体内的残留消除规律,国内研究的比较多,如王洪艳[11]等人研究了恩诺沙星及其代谢物环丙沙星在牙鲆体内代谢消除规律,研究结果表明恩诺沙星在牙鲆体内的代谢缓慢,脱乙基代谢只是在一段时间发生。张德云[12]等人研究了恩诺沙星在日本鳗鲡体内残留消除规律,得出恩诺沙星在肌肉中的残留要到90 d后才消除。但是很多研究[13-16]都是在健康的水产动物体内,而在实际生产中,药物是在患病条件下使用的,所以本文在构建疾病模型的基础上,研究了恩诺沙星及其代谢物在疾病模型下的残留消除规律,研究结果表明,恩诺沙星在肝脏中的消除半衰期在12 d以上,在肌肉中的半衰期在16 d以上,相比在健康的西伯利亚鲟[10]体内半衰期要长48 h,所以建议休药期的制定参考患病条件下的药时数据。

2.5 环丙沙星在人工感染细菌性疾病的西伯利亚鲟肝脏和肌肉中的残留消除规律

恩诺沙星以10 mg/kg剂量对人工感染嗜水气单胞菌的西伯利亚鲟口灌给药后,肌肉和肝脏中恩诺沙星代谢物环丙沙星的浓度随时间的变化关系见图3。给药后,肌肉和肝脏中恩诺沙星的吸收和消除完全不同,肝脏中环丙沙星浓度在15 min迅速达到峰值然后下降,在7.5 h时又出现一个峰值,而肌肉中药物浓度是先上升后下降,再逐渐平稳。数据经处理后,得到肝脏和肌肉中药物浓度与时间关系的消除方程、相关系数及消除半衰期:肝脏C=4.412e-0.007t(R2=0.758),消除半衰期T(1/2)β为148.4 h;肌肉C=4.915e-0.004t(R2=0.805)消除半衰期T(1/2)β为219.904 h;从中还可以看出,给药后,恩诺沙星首先在肝脏中代谢为环丙沙星,然后逐渐吸收,随着代谢的持续,出现另一个峰值,而在肌肉中恩诺沙星代谢为患病沙星的吸收较少,出现峰值后,消除也比较缓慢。

图3 人工感染条件下口灌给药后组织中环丙沙星的药时曲线Fig.3 Tissue ciprofloxacin concentration-time profile following oral administration

章海鑫[17]等人在研究双氟沙星在人工感染嗜水气单胞菌的异育银鲫药动学时发现,药物在人工感染的异育银鲫体内的吸收、分布、代谢、消除等减慢。赵青松[18]等人在研究氟苯尼考在三疣梭子蟹疾病模型内的代谢动力学时发现,患病体内各组织中氟苯尼考的达峰时间、半衰期等延长,表观分布容积和药时曲线面积增大。而国外Uno[19]的研究不同,他认为OTC在健康和患病的香鱼体内的消除半衰期差不多,只是与健康鱼相比,生物利用度有所下降。本实验结果,通过比较健康[10]和人工感染嗜水气单胞菌西伯利亚鲟体内的药动学数据,发现与健康组相比较,恩诺沙星及代谢物环丙沙星的吸收和消除减慢,达峰时间、半衰期延长,表观分布容积、药时曲线面积变大,最高药物总体清除率下降。这与Ferran[20]等和Kesteman[21]等的研究类似,动物感染部位的菌量会影响药物药动学参数。也与刘彦[22]等人的研究达氟沙星在患病牙鲆中的总体消除率下降结果类似。大量的实验结果都表明,疾病会使得动物的机体发生变化,肝受损,进而影响药物的吸收和代谢。

2.6 恩诺沙星及其代谢物环丙沙星在人工感染西伯利亚鲟和健康体内的药代动力学特征比较

关于恩诺沙星在疾病模型水产动物体内的药动学,国内报道较少。本实验以恩诺沙星10 mg/kg剂量对人工感染嗜水气单胞菌的西伯利亚鲟口灌给药后,药时数据用3P97药物代谢动力学软件分析,血浆中恩诺沙星和环丙沙星药物浓度时间关系符合有吸收二室模型,恩诺沙星和环丙沙星的药动学方程分别为:C=0.928e-0.160t+0.257e-0.0115t-1.185e-12.481t(R2=0.902)和C=0.676e-0.0848t+0.00162e-0.00412t-0.682e-0.120t(R2=0.881)。药物代谢动力学参数结果见表4。

表4 恩诺沙星及代谢物环丙沙星在健康和感染西伯利亚鲟体内的药物代谢动力学参数

注:A,B为药时曲线对数图上曲线在横轴和纵轴上的截距;α,β分别为分布相、消除相的一级速率常数;K21由周边室向中央室转运的一级速率常数;K10由中央室消除的一级速率常数;K12由中央室向周边室转运的一级速率常数;Vd表观分布容积;AUC药-时曲线下面积;Lag time滞后时间;Ka为一级吸收速率常数;T(1/2)Ka为药物在中央室的吸收半衰期;T(1/2)α、T(1/2)β分别为总的吸收和消除半衰期;Tmax出现最高血药质量浓度的时间;Cmax最高血药质量浓度;CL为总体清除率。

实验结果:在血浆中,与健康组药动学数据相比较,恩诺沙星的达峰时间Tmax由0.25 h升至0.365 h,峰浓度值Cmax值由1.119 mg/L降至0.329 mg/L,表观分布容积Vd由26.219 L/kg增至40.12 L/kg,吸收半衰期T(1/2)α由3.643 h推迟至5.732 h;消除半衰期T(1/2)β由32.046 h推迟至45.131 h。环丙沙星的达峰时间Tmax由0.5 h降至1.123 h,峰浓度值Cmax值由0.089 mg/L增为0.164 mg/L,吸收半衰期T(1/2)α由7.643 h推迟至8.17 h;消除半衰期T(1/2)β由32.046 h推迟至40.521 h。这与章海鑫[17]、刘彦[22]等的研究结果相同,与健康的药动学数据相比较,患病体内的药动学数据都发生了变化。除了水产动物,也有学者研究了小鼠、鸡、牛等的健康与疾病的药动学比较,如瞿颖[23]等人研究马坡沙星在健康和感染多杀性巴氏杆菌小鼠体内的药动学比较,研究结果表明感染组能显著改变马坡沙星在动物体内的分布、消除和代谢。薛伟芳[24]的研究结果显示,静注给药后,与健康组相比,感染组的甲砜霉素在体内的消除率降低。刘涤洁[25]的研究结果静注给药的金黄色葡萄球菌感染组比健康组药物消除减慢。

这表明,恩诺沙星在感染嗜水气单胞菌的西伯利亚鲟体内的吸收和消除速度减慢、半衰期延长、达峰时间延迟、表观分布容积和药时曲线下面积变大,说明疾病条件能显著改变药物在西伯利亚鲟体内的吸收、消除过程。

3 结论

嗜水气单胞菌人工感染西伯利亚鲟后,肝功能受损,血液的生化指标发生了变化,因此可以将1.5×109cfu/mL作为感染浓度,建立疾病模型。

在20 ℃条件下人工感染嗜水气单胞菌的西伯利亚鲟,然后以10 mg/kg计量口灌恩诺沙星,其药动学数据表明符合有吸收二室模型。与健康西伯利亚鲟相比,恩诺沙星及代谢物在受感染的西伯利亚鲟体内,吸收相对缓慢,消除也慢。因为药物是在鱼体患病条件下使用的,所以建议休药期依据疾病模型下的药物学数据。

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Pharmacokinetics of enrofloxacin and its metabolite ciprofloxacin inAcipenserbaeri

ZHAO Feng1,ZHOU Zhou1,*,LI Xiao-yi1,KONG Jie1,YANG Qiu-hong2,LIU Yong-tao2

(1.Fisheries Research Institute of Guizhou Province,Guiyang 550025,China;2.Yangtze River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Freshwater Fish,Wuhan 430223,China)

In this article,Acipenserbaeriwas treated orally with enrofloxacin(EF)via stomach tube at a single dose of 10 mg/kg at 20 ℃.Concentration of the drugs in muscle,liver and blood was determined by high performance liquid chromatography(HPLC).The concentration-time data were analyzed with 3p97.The results were as follows:the EF and its metabolite in blood concentration-time data were best described by two-compartment model,the time of peak concentration(Tmax)were 0.37 h and 1.12 h,the maximum EF and its metabolite concentration(Cmax)were 0.329 mg/L and 0.164 mg/L,the distribution half-life(T(1/2)α)were 5.732 h and 8.17 h,the elimination half-life(T(1/2)β)were 45.131 h and 40.521 h. Compared with the healthyAcipenserbaeri,the rate of absorption and elimination in diseasedAcipenserbaerislowed,maximum drug concentration decreased and half-liveextended,clean-up ratio and the peak time delayed,apparent volume of distribution and the area under the curve increased.The Elimination equations of EF in kidney and muscle were C=0.13e-0.005t,C=2.31e-0.006t. Those correlation coefficienta(R2)were≥0.825. The Elimination equations of CF in kidney and muscle were C=4.412e-0.007t,C=4.915e-0.004t,those correlation coefficienta(R2)were≥0.758.

enrofloxacin;Acipenserbaeri;disease model;pharmacokinetics

2016-08-12

赵凤(1987-),女,研究实习员,研究方向:水产品质量安全,E-mail:f0328eng@126.com。

*通讯作者:周洲(1985-),女,助理研究员,主要从事鲟鱼的繁殖及质量安全控制方面的研究,E-mail:zz1126277@163.com。

贵州省基金(黔科合J字[2013]2190号);省体系——疾病防控功能实验室(GZCYTX2013-01102);黔农科院院专项([2013]005号);贵州省攻关(黔科合NY[2015]3003-2)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)06-0124-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.015