液相色谱串联质谱法测定蜂产品中吡虫啉及其3种代谢物

梁秀美 ��王祥云 ��薛晓锋 ��齐沛沛 ��刘真真�ち踔�炜 ��周莉 ��王新全 ��王强

摘要建立了蜂蜜和蜂花粉中吡虫啉及其代谢物吡虫啉烯烃、吡虫啉脲、6氯烟酸的液相色谱串联质谱（LCMS/MS）检测方法。在QuEChERS方法基础上，针对目标物化学性质和样品杂质情况，对提取溶液的pH值、提取次数、净化材料等参数进行了优化。最终以5%甲酸乙腈溶液提取两次，无水MgSO4、NaCl盐析分层，提取液经增强型脂类去除材料（EMR）净化，以LCMS/MS进行测定，基质外标法进行定量分析。结果表明，蜂蜜和蜂花粉中吡虫啉、吡虫啉烯烃、吡虫啉脲、6氯烟酸的平均加标回收率为86.0%～111.5%，相对标准偏差在1.7%～9.6%之间，检出限分别为0.20＼，3.50＼，0.40和14.00μg/kg，定量限分别为0.60＼，11.64＼，1.20和45.00μg/kg。本方法分析速度快、灵敏度高、重现性好，适用于蜂蜜和蜂花粉中吡虫啉及其3种代谢物的快速测定。

关键词液相色谱串联质谱；蜂蜜；蜂花粉；吡虫啉；吡虫啉烯烃；吡虫啉脲；6氯烟酸；增强型脂类去除材料

1引言

新烟碱类杀虫剂为昆虫乙酰胆碱受体激动剂，是继有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类等杀虫剂之后的第四大类杀虫剂[1]。吡虫啉是其代表性药剂，主要用于防治水稻、小麦、棉田中的蚜虫、叶蝉、飞虱等30多种刺吸式口器害虫、地下害虫[2]。

吡虫啉对哺乳动物低毒，但对蜜蜂具有较大的潜在毒副作用[3]，主要包括高浓度下的急性毒性以及亚致死浓度下的学习能力降低[4]、记忆力下降[4，5]、出现非正常的觅食行为[6]及群势衰弱[7]等慢性毒性[8]。鉴于吡虫啉对蜜蜂的毒害作用，环保署与美国农业部于2013年4月重申“使蜂群远离新烟碱类农药”是保护蜂群的必要举措[3]。Severine等[9]的研究结果表明，吡虫啉的烯烃代谢物等具有与其母体相似的蜜蜂毒性，因此在评估蜂产品中吡虫啉残留对蜜蜂的风险时，应涵盖其代谢物残留的影响。吡虫啉及其部分代谢物的化学结构式见表1。

吡虫啉残留的分析检测方法较多，主要有液相色谱法[10，11]、液相色谱串联质谱法[12，13]，但其代谢物的检测方法较少[14，15]。Kamel等[14]建立了花蜜和花粉中吡虫啉、噻虫嗪、呋虫胺及其代谢物的LCMS/MS检测方法，以2%三乙胺乙腈提取、经C18小柱净化、氮吹浓缩后过膜进样，操作较为繁琐。Garcia等[15]建立了蜜蜂中吡虫啉和6氯烟酸的LC检测方法，该方法需要两次抽滤、两次萃取、旋蒸浓缩等步骤，且未涵盖吡虫啉烯烃及吡虫啉脲。本研究基于较为成熟的QuEChERS农药残留快速检测方法＼[16]，建立了蜂蜜和蜂花粉样品中吡虫啉以及吡虫啉烯烃、吡虫啉脲和6氯烟酸等3种代谢物残留量的LCMS/MS快速检测方法。经优化后，本方法以酸化乙腈提取两次，确保目标物的提取效率，以新型净化脱脂材料EMR替代传统的分散固相萃取净化材料，得到更佳的净化效果。结果表明，本方法简便、快速、准确、灵敏，可满足蜂蜜和蜂花粉中吡虫啉及其3种代谢物的快速测定要求。

2实验部分

2.1仪器与试剂

LC30A液相色谱仪（日本岛津公司）；4500型三重四极杆串联质谱（美国ABSCIEX公司）；68905975气相色谱质谱仪（美国Agilent公司）；HeraeusBiofugePrimoR离心机（美国ThermoScientific公司）；MTN2800D氮吹仪（北京华博科技制造有限公司）；QT2旋涡混合器（上海琪特分析仪器有限公司）；BSA2202S电子天平（北京塞多利斯科学仪器有限公司）；0.22μm滤膜（天津博纳艾杰尔公司）。

蜂产品（蜂蜜和蜂花粉，本地超市，本方法测定无吡虫啉及其代谢物残留）；吡虫啉标准品（1000mg/L，農业部环境质量监督检验测试中心（天津））；吡虫啉烯烃、吡虫啉脲、6氯烟酸标准品（纯度均为99.0%，德国Dr.EhrenstorferGmbH公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲酸铵（色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司）；三乙胺（TEA，色谱纯，美国ROEScientific有限公司）；QuEChERSKits提取粉（6g无水MgSO4、1.5gNaCl）、十八烷基硅烷（C18）、乙二胺N丙基硅烷（PSA）、石墨化炭黑（GCB），均购自天津博纳艾杰尔公司；ZSep（55299U，美国Supelco公司）；EMR净化管（59821010，美国Agilent公司）；无水MgSO4（分析纯，永华化学科技（江苏）有限公司）；实验用水为超纯水（MilliQ，美国Millipore公司）。

单标储备液：以乙腈定容，配制成质量浓度分别为40，388，420和879mg/L的吡虫啉、吡虫啉烯烃、吡虫啉脲、6氯烟酸单标储备液，于4℃保存。

混标工作液：分别准确移取适量上述单标储备液，以乙腈定容，配成吡虫啉质量浓度为1mg/L的吡虫啉混标（吡虫啉〖KG-3∶〖KG-5吡虫啉烯烃〖KG-3∶〖KG-5吡虫啉脲〖KG-3∶〖KG-56氯烟酸=1.0〖KG-3∶〖KG-519.4〖KG-3∶〖KG-52.0〖KG-3∶〖KG-575.0，m/m）储备液。于4℃保存，用时稀释成所需浓度。

2.2样品前处理

准确称取（5.00±0.05）g蜂产品于50mL离心管中，加入10mL水，涡旋混匀；随后加入10mL5%甲酸乙腈溶液，涡旋混匀3min，再加入QuEChERSKits提取粉，立即手动剧烈振摇30s，7000r/min离心3min。取上清液于另一个50mL离心管；下层样品再加5mL5%甲酸乙腈溶液重复提取一次，合并提取液，待净化。

EMR净化管预先加2mL水涡旋混匀30s进行活化；加入5mL上述提取液，涡旋混匀30s后，7000r/min离心3min；随后取全部上清液加1.4g无水MgSO4，以除去水分，涡旋混匀30s后，7000r/min离心3min。取0.5mL上清液于2mL离心管中，加入0.5mL水混匀，过0.22μm滤膜，待LCMS/MS测定。

2.3LCMS/MS测定条件

采用文献＼[14＼]中的仪器条件：UPLCHSST3色谱柱（10cm×2.1mm×1.8μm，美国Waters公司）；流动相A为水，流动相B为5mmol/L甲酸铵甲醇溶液；梯度洗脱程序：0～15min，95%A；15～16min，60%A；16～17min，5%A；17～19min，95%A。流速0.35mL/min，柱温40℃，进样量5μL。

质谱采用电喷雾离子源（ESI），正负离子切换扫描方式，选择多反应监测（MRM）模式，喷雾电压4000V，毛细管温度350℃；气帘气（400Pa）、碰撞气（7Pa）、喷雾气（30Pa）和辅助喷雾气（30Pa）均为氮气。各化合物的质谱采集参数见表1。

3结果与讨论

3.1溶液pH值对提取效率的影响

6氯烟酸为酸性化合物，因此本研究首先考察了2%三乙胺乙腈、乙腈、0.1%～5%甲酸乙腈等不同pH值溶剂对提取效率的影响。取一定浓度的吡虫啉混标溶液于离心管中，加H2O、NaCl和不同pH值的乙腈，涡旋混匀、离心后，取等体积的上层有机相和水，混匀过膜，待LCMS/MS测定。由图1可知，在2%三乙胺乙腈、乙腈的提取环境下，6氯烟酸的提取效率较低，这可能是因为在碱性和中性环境下〖CM（446氯烟酸以离子形式溶解于水中，降低了溶剂的提取效率；而在酸性条件下，6氯烟酸的提取效率显著〖CM）

增强。而文献＼[14＼]表明，以2%三乙胺乙腈提取后，经C18柱净化，LCMS/MS测定，6氯烟酸的回收率在64.1%～93.0%之间，即2%三乙胺乙腈对6氯烟酸具有良好的提取效果，这与本实验的结果存在一定的差异。为保障6氯烟酸的提取效率，同时兼顾其它待测物的回收率情况，本实验最终选择5%甲酸乙腈为提取溶液。

3.2净化过程

蜂花粉虽然源于植物花粉，但在其生产过程中，蜜蜂通过混入蜡腺分泌物而形成，从而含有较多蜡质。Wiesta等[17]采用正己烷萃取和冷冻等方法去除了蜂花粉中的油脂。本研究也进行了相应的尝试，但效果并不理想。此外，文献＼[18，19＼]报道ZSep和EMR等净化材料对于油脂类干扰具有较好的去除效果。因此，本实验在QuEChERS方法常用净化材料C18、PSA、GCB之外，对ZSep、EMR等新型净化材料进行了考察。取样品提取液，分别采用C18，PSA，GCB或ZSep等材料进行净化；或取样品提取液于EMR净化管中净化（方法同2.2节），净化后经脱水过膜，以GCMS测定，其总离子流图（TIC，图2和图3）表明，蜂蜜提取液本身较为纯净，5种净化材料均可满足实验要求；蜂花粉提取液则有较多的干扰物质，5种净化材料均有一定的净化效果，其中EMR的净化效果明顯优于其它4种净化材料。其原因可能是EMR通过疏水作用选择性吸附长链脂类，形成脂类EMR联合体，并通过离心沉淀或溶于水相的形式实现对提取液的有效净化[19]。

3.3净化材料对回收率的影响

文献＼[14＼]表明，在2%三乙胺乙腈的提取条件下，PSA对6氯烟酸具有强烈的吸附作用，导致添加样品中6氯烟酸回收率为0。因此，本研究在5%甲酸乙腈的提取条件下，考察了C18、PSA、GCB、ZSep、EMR等备选净化材料对待测物回收率的影响。除在空白基质提取液（见2.2节）加入一定浓度的标准溶液以及采用LCMS/MS测定外，其余步骤同3.2节。结果见图4，在5%甲酸乙腈提取条件下，除GCB对6氯烟酸有吸附外，其它净化材料对回收率均无明显影响。GCB对6氯烟酸的吸附则源于6氯烟酸本身的平面结构[16，20]。

3.4基质效应

采用LCMS/MS进行残留测定时应尽量避免基质效应[21]，同时基质效应也可反映净化效果。为比较C18、PSA、ZSep和EMR的净化效果，分别以4种材料对蜂蜜、蜂花粉提取液（见2.2节）进行净化，并配制吡虫啉及其代谢物的系列浓度基质标准溶液，同时配制相应的溶剂标准溶液。经LCMS/MS测定后，以化合物的峰面积和浓度作图，绘制标准曲线。以不同基质标准线性回归方程的斜率与溶剂标准液的斜率比值评判基质效应的程度：比值>1，表明存在基质增强效应；比值<1，存在基质抑制效应；比值越接近1，则基质效应越小，净化效果越好；当比值远离1，表明存在明显的基质效应，必要时需进一步净化。本实验结果表明，经C18、PSA、ZSep、EMR分别净化后，蜂蜜中吡虫啉及其3种代谢物的比值在0.96～1.06之间，基质效应轻微。蜂花粉提取液中的基质效应较强，具体结果如图5所示：除6氯烟酸存在一定的基质增强效应，其余待测物均呈现出明显的基质抑制效应；其中C18、PSA、ZSep和EMR抑制效应总体呈依次减弱，这也说明其净化效果依次增强。虽然ZSep和EMR的基质效应较为接近，考虑到其在3.2节实验中表现出了最佳的净化效果，本实验最终选择EMR作为净化材料。

3.5确定提取次数

为确保蜂蜜，尤其是蜂花粉中吡虫啉及其代谢物的提取效率，进一步考察了提取次数的影响。结果表明，蜂蜜中的待测物在第2次提取时仍有1%～5%的残留，而第3次提取时则仅有<0.5%的残留；蜂花粉中的待测物提取效率相对较低，第2次提取时尚有6%～16%的残留，第3次提取时仍有约3%的残留。因此，两次提取即可将蜂蜜和蜂花粉中97%以上的待测物充分提取。本实验最终对蜂蜜和蜂花粉样品进行两次提取，以确保提取效率。

3.6线性范围、检出限和定量限

在2.3节的色谱条件下，配制吡虫啉及其代谢物的系列基质标准溶液，经LCMS/MS测定后，以化合物的峰面积和浓度做图，绘制标准曲线。以添加回收样品峰响应值为3倍噪音的添加浓度为方法检出限（LOD），以10倍噪音的添加浓度为方法定量限（LOQ）。具体结果见表2，在蜂蜜和蜂花粉中，2吡虫啉、吡虫啉烯烃、吡虫啉脲、6氯烟酸的LOD分别为0.20＼，3.50＼，0.40和14.00μg/kg，LOQ分别为0.60＼，11.64＼，1.20和45.00μg/kg，相关系数在0.9992～1.0000之间，能够满足定量分析的基本要求。

3.7準确度和精密度

在蜂蜜和蜂花粉中添加适当体积的吡虫啉混合标准溶液，使添加水平均分别为LOQ，5LOQ和10LOQ。由表3可知，在蜂蜜和蜂花粉中，4种化合物的平均加标回收率在86.0%～111.5%之间，相对标准偏差（RSD）在1.7%～9.6%之间，方法具有较好的回收率和重现性。

[LM][HT5”SS][HJ*4]表3蜂蜜和蜂花粉中的加样回收率和相对标准偏差（n=5）

Table3RecoveryandRSDofspikedhoneyandpollen（n=5）

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AbstractAmethodwasdevelopedforthedeterminationofimidaclopridanditsmetabolitesimidaclopridolefin，imidaclopridureaand6chloronicotinicacidinhoneyandbeepollenbyliquidchromatographytandemmassspectrometry（LCMS/MS）.OnthebasisoftypicalQuEChERSmethod，thepHandtimesofextractionsolvent，sorbentswereoptimizedtoensuretheextractionefficiencyandthepurificationofextraction.Finally，themethodwasdevelopedasfollows：matrixwasextractedwith5%formicacidacetonitriletwice，andtheextractionwascleanedwithenhancedmatrixremovallipid（EMR），detectedwithLCMS/MSandquantifiedwithexternalmatrixstandards.Theresultsindicatedthattheaveragespikedrecoveriesofimidacloprid，imidaclopridolefin，imidaclopridureaand6chloronicotinicacidinhoneyandpollensampleswere86.0%-111.5%withrelativestandarddeviations（RSDs）of1.7%-9.6%，theLODswere0.20，3.50，0.40and14.00μg/kg，andtheLOQswere0.60，11.64，1.20and45.00μg/kg.Themethodwasrapidandsimplewithhighsensitivityandgoodreproducibility，andsuitableforthedeterminationofimidaclopridanditsthreemetabolitesresiduesinhoneyandbeepollen.

KeywordsLiquidchromatographytandemmassspectrometry；Honey；Hollen；Imidacloprid；Imidaclopridolefin；Imidaclopridurea；6Chloronicotinicacid；EnhancedmatrixremovalLipid

（Received15November2016；accepted6February2017）