刚地弓形虫棒状体蛋白18及其作为基因工程疫苗候选分子研究进展

刘荣荣，张晓磊，张进顺

(河北北方学院病原生物学与免疫学研究所，河北张家口 075000)

刚地弓形虫棒状体蛋白18及其作为基因工程疫苗候选分子研究进展

刘荣荣，张晓磊，张进顺*

(河北北方学院病原生物学与免疫学研究所，河北张家口 075000)

刚地弓形虫棒状体蛋白18(rhoptry protein18,ROP18)是由棒状体分泌的、属于棒状体蛋白2家族的一员，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，在虫体入侵和毒力的发挥方面起着重要作用。论文就ROP18蛋白的结构、毒力和作用机制及其作为基因疫苗候选分子的研究现状进行综述。

刚地弓形虫；棒状体蛋白18；毒力；作用机制；基因疫苗

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)属于顶复门原虫，是专性细胞内寄生虫，是人类重要的机会致病性病原体，尤其对于与T细胞相关的先天或获得性免疫缺陷的患者更具有危害性[1]。猫及其他猫科动物是其终宿主，人类及猪、牛、羊等畜禽类动物为其中间宿主。人类感染弓形虫后在免疫功能良好的患者表现为无临床症状的慢性持续性感染，虫体可以包囊形式持续存在于感染者组织中，如大脑、骨骼肌、心脏等。但是在免疫功能受损的患者，比如人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者、肿瘤患者和器官移植者等其他免疫功能受到抑制的个体，感染弓形虫后会对身体健康造成严重损害[2],如果CD4+T细胞数小于200 μL虫体将会处于有侵袭性的速殖子状态[3],速殖子可感染任何类型细胞和组织并在其内复制最终导致细胞裂解死亡，进而侵袭临近正常细胞和组织，可表现为视网膜脉络炎和脑炎等，联合国粮食及农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)已将弓形虫列为食源性感染性寄生虫[4]，弓形虫感染引起了全球性的关注。弓形虫感染的流行不仅对人类健康产生严重危害，而且对畜牧业造成相当大的经济损失[5]。Luo H等[6]运用间接血凝试验对江西省动物园内的野生动物进行弓形虫抗体检测，结果显示长颈鹿阳性率为27%，狼的阳性率为20%，河马的阳性率为17%，冻原天鹅的阳性率为22%，同时用同样的方法对江西省13个县境内的畜类进行调查，山羊的阳性率为10%，水牛的阳性率为17%，牛的阳性率为11%。鉴于弓形虫感染的危害和流行，弓形虫致病机理的研究和预防弓形虫感染的疫苗研制引起了广大学者的重视，研究成果正在不断刷新。本文就弓形虫棒状体ROP18及其作为基因疫苗候选分子的研究进展进行综述。

1 ROP18的结构、毒力和作用机制

弓形虫在与宿主接触并入侵过程中主要有3类细胞器发挥作用，包括微线体(microneme)、棒状体(rhoptry)和致密颗粒(dense granule)。棒状体蛋白在虫体侵入宿主细胞的初期分泌至纳虫空泡或是插入在纳虫空泡膜上[7]，多数棒状体蛋白与虫株的毒力和虫体在宿主细胞内的增殖有关[8]。ROP18属于棒状体蛋白2家族的一员，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，被认为是重要的毒力决定因子而被广泛关注[9]。

1.1 ROP18的结构

了解ROP18的结构是探究其作用机制和研制疫苗的先决条件。生物信息学分析表明ROP18是含有554个氨基酸的亲水性分泌蛋白，保守结构区域有10个，其中含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化区域和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活化位点区域[10]，证明ROP18是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该蛋白序列C端是含丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的疏水区[11]，N端富含精氨酸，该区突变的ROP18突变体在虫体入侵宿主细胞后ROP18不能与纳虫空泡膜(parasitophorous vacuole membrane，PVM)结合[12]，表明N端富含精氨酸的区域介导ROP18与纳虫空泡膜的结合，对于ROP18发挥关键毒力因子的作用是至关重要的。ROP18的三维晶体结构呈丝氨酸/苏氨酸激酶折叠方式，激酶结构域位于187-554位氨基酸之间，有两个配体结构域，一个为N端223-347位氨基酸之间的蔗糖结合口袋，另一个为ATP结合口袋[13]，其中蔗糖结合口袋中的两个关键位点ROP18Arg223和ROP18Met284与弓形虫的毒力直接相关[14]。

1.2 ROP18的毒力

弓形虫的基因型主要分为强毒力株Ⅰ型、中等毒力株Ⅱ型和弱毒力株Ⅲ型[15]。研究发现[16]，将Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型弓形虫虫株杂交，筛选出与弓形虫毒力高度相关的棒状体蛋白激酶基因ROP18，该基因位于弓形虫第Ⅶ号染色体上。ROP18是Ⅰ型弓形虫在鼠体内的重要毒力决定因子[17]，是不同虫株间毒力差异的原因之一。 将Ⅰ型虫株的ROP18基因转染Ⅲ型虫株，结果使虫株的增殖速率急剧增大，对小鼠模型的致死力提高4～5个数量级[18]，证明ROP18 在不同虫株的毒力调节中是关键蛋白分子之一。

1.3 ROP18的作用机制

弓形虫在侵入宿主细胞的过程中逐渐在其周围形成PVM将虫体包围，以此来躲避宿主的杀伤机制。免疫相关GTP酶(IRGs)是GTP酶家族的一员，也称p47，Irgb6、Irgb10、Irga6和Irgd是IRGs的四大成员。细胞在正常状态下IRGs处于低表达水平，但在IFN-γ的诱导下可高度表达[19]。当虫体入侵后，宿主的抗弓形虫适应性免疫反应被激活，T细胞和巨噬细胞产生多种与抗弓形虫感染相关的免疫上调因子如γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-12等，以及下调因子如IL-4、 IL-6、IL-10 等。在IFN-γ的诱导下，新合成的IRGs被转运至PVM上(转运机制有待研究)[20]，最终使PVM破裂达到清除虫体的目的。研究表明[21]，在感染弓形虫90 min之内IRGs完成在 PVM 上的积累，是宿主细胞抑制鼠弓形虫的主要途径。但Ⅰ型虫株感染时，ROP18分泌并被运送至PVM上，磷酸化IRGs的一个关键激酶结构域，从而阻止IRGs在PVM的聚集，发挥毒力作用，打破宿主固有的抗感染机制。其中Irgb6被认为是ROP18磷酸化的特定作用对象[22]。ROP18磷酸化IRGs是通过和ROP5形成复合物灭活IRGs的活性的[23]，ROP5是ROP18的辅助因子，可以将IRGs蛋白锁定在无活性的GDP结合状态，同时将IRGs上的苏氨酸位点暴露给ROP18，被ROP18磷酸化，使IRGs上的GTP结合位点被破坏，IRGs不再被激活，IRGs堆积的级联反应不能发生。最近研究表明[22]，致密颗粒7(GRA7)为ROP18/ROP5复合物的辅助因子，对于ROP18激酶活性的实现和特异性地使Irga6失活是必需的。GRA7通过与ROP5直接结合而锚定在PVM上，三者共同发挥作用阻止PV被宿主免疫系统裂解。GRA7的缺失将导致PVM上磷酸化Irga6的IRGs蛋白数量增多，并且会使虫株的毒力减弱。

Yamamoto M等[24]发现内质网转录因子6β(ATF6β)是ROP18的另一个作用靶点，ATF6β是定位于宿主内质网的转录因子，ROP18通过磷酸化ATF6β的至少一个苏氨酸位点使ATF6β经蛋白酶体途径降解，下调由CD8+T细胞介导的Ⅰ型获得性免疫反应，从而干扰宿主的获得性免疫系统。

此外，ROP18还可以抑制NF-κB信号通路。转录因子NF-κB蛋白家族包括p50 (NF-κB1)、p52 (NF-κB2)、p65 (RelA)、RelB和c-Rel等5个亚单位。ROP18N-末端部分与p65的二聚化结构域相关，ROP18磷酸化p65蛋白的468位苏氨酸并靶向泛素依赖性途径将p65降解[25]。除上述作用机制外，利用酵母双杂交技术筛选出7种人胎脑cDNA文库中与ROP18相互作用的因子，包括DDB1、TOR1AIP1、integrin、SLC3A2、TPST2、DERL2和OCIAD1[26]，说明ROP18与宿主的作用机制复杂多样。

2 ROP18作为基因疫苗候选分子的研究

免疫预防是控制弓形虫病的有效途径，基因疫苗是继全虫疫苗和亚单位疫苗之后的第三代新型疫苗，已被国内外学者广泛探究和运用。ROP18在弓形虫入侵和毒力的发挥方面扮演重要角色，具有较好免疫原性，因此作为抗弓形虫疫苗的候选蛋白被高度重视和研究。

2.1 ROP18单基因疫苗

张颖等[27]构建原核表达重组质粒pET30a(+)-TgROP18，经Western blotting分析表明ROP18能被鼠抗弓形虫多克隆抗体识别，验证了ROP18具有良好的抗原性，可以作为疫苗候选分子。Yuan Z G等[28]构建真核表达重组质粒PVAX1-ROP18免疫昆明小鼠，产生较高水平的抗弓形虫IgG2a抗体,CD69表达增高，说明ROP18可以刺激小鼠产生CD4+和CD8+T淋巴细胞，激发体液免疫和Th1型细胞免疫；小鼠存活时间(27.9±15.1 d)较对照组(7 d)明显延长，证明ROP18具有良好的免疫保护作用。

2.2 复合基因疫苗

复合基因疫苗是将多个不同抗原的编码基因克隆到一个表达载体上，一次可表达多个抗原达到更多的靶向作用，以此来提高免疫效果。石娜等[29]用重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18免疫小鼠，结果显示复合基因组的小鼠血清抗体OD值明显高于单基因组(P<0.05)；对小鼠脾细胞培养液中的细胞因子进行测定，结果表明复合基因组的细胞因子浓度要高于单基因组(P<0.05)；用弓形虫RH株速殖子攻击小鼠后，复合基因组的生存率明显高于单基因组(P<0.05)。陈琳等[30]成功构建重组质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2,免疫小鼠后发现复合基因组的特异性抗体IgG1和IgG2值、细胞因子IFN-γ和IL-4浓度都高于单基因组(P<0.05)；进行弓形虫速殖子攻击后，复合基因组的小鼠生存率也明显高于单基因组(P<0.05)。说明复合基因的免疫效果存在一定的优势，能产生较强的细胞免疫和体液免疫。目前商品化的抗弓形虫疫苗只有用于免疫绵羊的疫苗，用于人的疫苗还未见报道，这是未来研制弓形虫疫苗面临的一大挑战。

综上所述，关于宿主和弓形虫相互作用机制的研究取得了较大成果，但由于弓形虫生活史和致病机理的复杂性，许多机制还没有被完全阐明。随着分子生物学和生物信息学的发展，相信弓形虫的免疫机制和致病机理将会得到更深入了解，针对作用机制研制的基因疫苗也将会更加有效。

[1] Hunter C A,Sibley L D.Modulation of innate immunity byToxoplasmagondiivirulence effectors [J].Nat Rev Microbiol,2012,10(11):766-778.

[2] Grzybowski M M,Gatkowska J M,Dziadek B,et al.Human toxoplasmosis:a comparative evaluation of the diagnostic potential of recombinantToxoplasmagondiiROP5 and ROP18 antigens[J].J Med Microbiol,2015,64 (10):1201-1207.

[3] Basavaraju A.Toxoplasmosis in HIV infection:An overview[J].Trop Parasitol,2016,6(2):129-135.

[4] Robertson L J,van der Giessen J W,Batz M B,et al.Have foodborne parasites finally become a global concern?[J].Trends Parasitol,2013,9(3):101-103.

[5] Rahimi M T,Daryani A,Sarvi S,et al.Cats andToxoplasmagondii:A systematic review and meta-analysis in Iran[J].Onderstepoort J Vet Res,2015,82(1):e1-e10.

[6] Luo H,Li K,Zhang H,et al.Seroprevalence ofToxoplasmagondiiinfection in zoo and domestic animals in Jiangxi Province,China[J].Parasite,2017,24(7):887-892.

[7] Boothroyd J C,Dubremetz J F.Kiss and spit:the dual roles ofToxoplasmarhoptries[J].Nat Rev Microbiol,2008,6(1):79-88.

[8] 徐 颖,高 琦,徐前明,等.弓形虫棒状体颈部蛋白及棒状体蛋白研究的新进展[J].中国人兽共患病学报,2013,29(12):1217-1221.

[9] 张 贤,甘小凤,程正阳,等.弓形虫棒状体蛋白2家族成员研究进展[J].中国病原生物学杂志,2015,10(6):574-576.

[10] 郭玲玲,张晓磊,张进顺.刚地弓形虫ROP18基因的克隆及生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志,2015,10(5):414-419.

[11] 尹 昆,张佃波,闫 歌.弓形虫毒力决定因子ROP18的研究进展[J].中国病原生物学杂志,2013,8(11):1051-1055.

[12] Khan A,Taylor S,Ajioka J W,et al.Selection at a single locus leads to widespread expansion ofToxoplasmagondiilineages that are virulent in mice[J].PLoS Genet,2009,5(3):e1000404.

[13] 尹 昆,寇景轩,王利磊,等.靶向弓形虫毒力决定因子ROP18激酶抑制剂的虚拟筛选[J].中国病原生物学杂志,2015,10(6):525-530.

[14] Lim D,Gold D A,Julien L,et al.Structure of theToxoplasmagondiiROP18 kinase domain reveals a second ligand binding pocket required for acute virulence[J].J Biol Chem,2013,288(48):34968-34980.

[15] Dardé M L,Bouteille B,Pestre-Alexandre M.Isoenzyme analysis of 35Toxoplasmagondiiisolates and the biological and epidemiological implications[J].J Parasitol,1992,78(5):786-794.

[16] Taylor S,Barragan A,Su C,et al.A secreted serine-threonine kinase determines virulence in the eukaryotic pathogenToxoplasmagondii[J].Science,2006,314(5806):1776-1780.

[17] 刘苗苗,周 鹏,朱兴全.弓形虫棒状体蛋白的研究进展[J].中国人兽共患病学报,2008,38(5):443-446.

[18] Khan A,Taylor S,Ajioka J W,et al.Selection at a single locus leads to widespread expansion ofToxoplasmagondiilineages that are virulent in mice[J].PLoS Genet,2009,5(3):e1000404.

[19] 郑 斌,陆绍红.刚地弓形虫免疫逃避相关分子的研究进展[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2012,30(5):396-400.

[20] 赵桂华,尹淑霞,尹 昆.弓形虫棒状体蛋白与宿主细胞互作的研究进展[J].中国血吸虫病防治杂志,2014,26(4):453-456.

[21] Taylor G A.IRG proteins:key mediators of interferon regulated host resistance to intracellular pathogens [J].Cell Microbiol,2007,9 (5): 1099-1107.

[22] Hermanns T,Müller U B,Könen-Waisman S,et al.TheToxoplasmagondiirhoptry protein ROP18 is an Irga6-specific kinase and regulated by the dense granule protein GRA7[J].Cell Microbio,2016,18(2):244-259.

[23] Fleckenstein M C,Reese M L,Könen-Waisman S,et al.AToxoplasmagondiipseudokinase inhibits host IRG resistance proteins[J].PLoS Biol,2012,10 (7):e1001358.

[24] Yamamoto M,Ma J S,Mueller C,et al.ATF6beta is a host cellular target of theToxoplasmagondiivirulence factor ROP18[J].J Exp Med,2011,208 (7):1533-1546.

[25] Du J,An R,Chen L,et al.Toxoplasmagondiivirulence factor ROP18 inhibits the host NF-κB pathway by promoting p65 degradation[J].J Biol Chem,2014,289(18):12578-12592.

[26] Cheng L,Chen Y,Chen L,et al.Interactions between the ROP18 kinase and host cell proteins that aid in the parasitism ofToxoplasmagondii[J].Acta Trop,2012,122(3):255-260.

[27] 张 颖.刚地弓形虫强毒株棒状蛋白ROP18 的克隆、表达和免疫反应性分析[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2012,30(6):446-449.

[28] Yuan Z G,Zhang X X,Lin R Q,et al.Protective effect against toxoplasmosis in mice induced by DNA immunization with gene encodingToxoplasmagondiiROP18[J].Vaccine,2011,29(38):6614-6619.

[29] 石 娜.弓形虫基因疫苗pBudCE4.1-AMA1-ROP18免疫小鼠的保护作用研究[D].山东大学,2012.

[30] 陈 琳.弓形虫ROP18-MIC2双基因疫苗对小鼠的免疫保护性研究[D].山东大学,2012.

2017-04-17

河北省自然科学基金项目(H2013405091)；河北北方学院校级重大课题(ZD201312)

刘荣荣(1990-)，女，河北石家庄人，硕士研究生，主要从事寄生虫分子生物学研究。*

S852.4

A

1007-5038(2017)12-0104-04