牛卵母细胞及着床前胚胎发育的蛋白质组学研究进展

濮黎萍 陈富美 赵秀玲 王焕景 候振 徐壮壮 张鹏飞 张明

（广西大学动物繁殖研究所 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004）

牛卵母细胞及着床前胚胎发育的蛋白质组学研究进展

濮黎萍 陈富美 赵秀玲 王焕景 候振 徐壮壮 张鹏飞 张明

（广西大学动物繁殖研究所 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004）

蛋白质组学作为一种能够全景式展示特定生物学过程的蛋白质表达谱的高通量研究手段，正被应用到越来越多的研究领域。牛的卵子发生以及着床前胚胎的生长发育都离不开蛋白质的一系列变化，通过蛋白质组学的研究手段可对牛卵母细胞成熟以及胚胎发育分子机制进行研究。前人通过构建成熟前后的卵母细胞或不同时期的着床前胚胎等的蛋白质组表达谱，来获得与卵母细胞成熟相关的标志蛋白，并对这些标志物进行验证和分析，将有利于理解牛卵母细胞成熟、体外受精及着床前胚胎发育的分子机制，为提高牛卵母细胞的成熟率以及胚胎的发育率及提高牛繁殖率等奠定基础。主要从双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、色谱技术以及质谱技术等蛋白质组学研究手段为切入点，对蛋白质组学在牛卵母细胞和着床前胚胎发育过程中的研究进展进行综述，为进一步研究牛卵母细胞及附植前胚胎提供参考。

蛋白质组；卵母细胞；着床前胚胎

哺乳动物卵原细胞的增殖和卵母细胞的形成均是在胎儿娩出前或者娩出后不久完成的［1］。牛的卵原细胞增殖大多会在胎儿期的前半期完成。卵原细胞经过最后一次有丝分裂得到一个初级卵母细胞（Primary oocyte），初级卵母细胞经发育调控后进行成熟分裂，并在初情期到来之前一直停留在第一次减数分裂的双线期（MetaphaseI，MI）［2］。一般通过激素作用卵母细胞才能恢复分裂，经排卵与减数第一次分裂后静止在减数第二次分裂中期减数分裂中期（MetaphaseII，MII），直到精子、化学或者物理的刺激才能完成减数第二次分裂，同时在卵母细胞生长过程中已完成了对卵母细胞成熟、受精以及启动受精卵发育的相关RNA和蛋白质的合成［3-7］。

研究人员往往从基因组水平、转录组水平以及某个特定的蛋白质来对卵母细胞或者着床前胚胎进行研究。然而有研究证明，卵母细胞的转录水平和蛋白质表达水平呈现非线性关系，而且蛋白质的丰度较低时表现的更为明显［8］。蛋白质担任着生命活动主要承担者以及体现者的角色，且具有种类多、功能与性质各异等特点。因此在对卵母细胞以及着床前胚胎进行研究时，有必要运用蛋白质组学对其进行蛋白质表达水平的研究。这一定程度的推动了人们对卵子发生以及着床前胚胎发育机理的了解。

澳大利亚学者Wilkins等［9］于1994年首次定义了蛋白质组（Proteome），它是指一个基因组、一个细胞或者组织表达的全部蛋白质［9-10］。在21世纪这个蛋白质组学时代，蛋白质组学也成为了研究热点。蛋白质组学旨在大规模水平上对蛋白质的特征进行研究，其包括蛋白之间的相互作用、翻译后修饰以及蛋白表达水平等，从而从蛋白质组水平上了解细胞的各种生命活动过程。本文简单的综述了一些常用的蛋白质研究技术，以及目前牛卵母细胞和附植前胚胎蛋白质组的研究进展，旨为后续进一步的研究提供参考［11-12］。

1 蛋白质组学常用的研究技术

分析研究蛋白质组必定会涉及到蛋白的分离、蛋白的纯化、蛋白的定性和蛋白的定量等研究技术。蛋白质组学研究的常用技术有如下几个。

1.1 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳

O’farrell和Klose在1975年建立了双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D-PAGE）。2D-PAGE是依据蛋白质的等电点和分子大小来将蛋白质进行分离的［13］。2D-PAGE的优势在于它可以一次性分离上千种蛋白质，分辨率高，可更直观的获得蛋白质等电点、表达丰度的相对量及相对分子量等这些结果，所以2D-PAGE也是蛋白组分析的主要手段之一［14］。但是2D-PAGE仍存在众多的不足，包括上样量要求较多，对极酸性的、极碱性的、低丰度蛋白以及高疏水性蛋白分离不理想等［15-17］。

1.2 色谱技术

色谱法是利用样品中各组分溶于流动相后，再与固定相发生离子、亲和吸附等相互作用，从而使各组分从固定相中出来的时间不同，最终达到分离的目的。从流动相的物理状态分，色谱法主要包括液相色谱法（Liquid chromatography，LC）与气相色谱法（Gas chromatography，GC）。LC又可分为液液、液固及超临界流体色谱法，其中液液色谱法由于流动相及固定相的极性不同又将其区分为正相与反相液相色谱法。正相主要是将极性较强与中等的化合物分离，而反相主要是将极性较弱与非极性化合物分离。GC不能用于分析大部分热稳定性差与金属盐类的物质，因此常常借助LC尤其是高效液相色谱法进行分析［18］。

高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）是在液相色谱法上辅以灵敏度高的检测器、高效固定相、高压泵及计算机技术的运用，具有高速、高效、高灵敏及高自动化的优势，可用于分离分析热稳定性差、沸点高以及分子量大的部分无机物与大多有机物，也正可以填补气相色谱法的弊端。但是在检测器的检查范围、灵敏度与分离效率等方面，特别是在对易挥发物质的分析及气体的分析方面，GC更加优于HPLC［18-20］。

多维液相分离系统是将几种分离原理特性不同的液相分离方法优化并结合在一起，具有分辨率高、高通量、重复性好、快速及自动化高等优势［19］。多维液相分离系统常常与质谱技术共同使用，达到更好的对蛋白质组进行分离、分析及鉴定［18-21］。

1.3 质谱

1906年的诺贝尔物理学奖得主Thomson打下了质谱分析的基石［22-23］。质谱是将离子化的蛋白分子经过磁场或者电场后，依据其质荷比不同来确定蛋白质或者肽段的分子量［24］。质谱的优势在于它自动化高、快速、重复性好及灵敏等。因此，质谱成为了鉴定蛋白质的主要技术［25］。

比较常用的质谱技术主要有电喷雾电离质谱（Electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）及电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）等，这两种技术均可以在离子化时基本避免样品分子的离子碎片产生，使其本身的化学结构得以保持［26］。液态样品进行分析时主要使用ESI-MS，且常将其与串联质谱一起使用［27］。串联质谱被用来测定氨基酸序列以及鉴定翻译后蛋白质的修饰位点［28］。MALDI-TOF MS主要可以同时分析成千上百的肽段质量指纹图谱，且自动化高，不用纯化蛋白质，所以在目前鉴定分析蛋白方面最常用［28］。

质谱多反应检测技术（Multiple reaction monitoring，MRM）是比较前沿的质谱分析方法，是由单反应监测技术演变过来的，MRM技术是在假定或者已知的反应离子信息的基础上，将不符合规则的离子信号干扰去除并对符合规则的离子信号进行记录，达到有目的性地选择数据进行质谱信号的采集，最后经过对数据统计分析，进而得到质谱的定量信息［29-30］。质谱MRM技术具有高重复性、高灵敏度、高准确度以及高特异性等优点，成为了目标蛋白进行定量分析的重要技术手段［31］。

2 牛卵母细胞蛋白质组在发育过程中的研究进展

2004年，Coenen等［32］使用双向凝胶电泳（Twodimensional electrophoresis，2-DE）技术研究牛卵母细胞体外成熟过程中的蛋白质合成。实验结果显示，牛卵母细胞在体外成熟的过程中，蛋白质合成有3种主要模式：0-4 h的成熟初期，4-16 h的生发泡破裂（Germinal vesicle breakdown，GVBD）向MI转变期，16-28 h的MI期结束后。在卵母细胞的成熟第4-8 h蛋白质合成效率较高，并一直持续至MI期（8-12 h），然后合成率下降，最后保持相对稳定。卵母细胞成熟初期有一半的蛋白质开始合成，有许多与GVBD和MII期的维持相关的新蛋白分别在4-8 h和16-12 h出现。有一些蛋白与受精也相关，而且15%“管家蛋白”家族的蛋白在0-28 h这整个成熟过程中一直在合成，它们的作用主要是保持卵母细胞的功能及其结构。

2006年，Massicotte等［33］利用2-DE、MALDITOF和MS/MS技术对牛卵母细胞进行了相关的研究。实验结果获得蛋白点共550个，并发现卵母细胞在成熟过程中发生磷酸化修饰的蛋白有30%-50%，其中在培养过程中有4种蛋白表达变化显著，包括细胞周期蛋白E2、硫氧还蛋白过氧化物酶、微管蛋白β链以及蛋白二硫化合物异构酶，且细胞周期蛋白E2表达下调，硫氧还蛋白过氧化物酶在磷酸化修饰后失活。而胞内过氧化物水平的变化可能是由于这些蛋白表达的改变而引起的，因此细胞周期蛋白E2与硫氧还蛋白过氧化物酶可当作卵母细胞减数分裂成熟的标志分子。

2007年，Memili等［34］利用LC-MS/MS技术研究了牛的颗粒细胞与未成熟卵母细胞的蛋白质组。实验结果显示，颗粒细胞中鉴定得到4 395个蛋白，而未成熟卵母细胞中鉴定得到1 092个蛋白，而且有858个蛋白是颗粒细胞与未成熟卵母细胞所共有的，该研究使5 360个假设的蛋白质得到了第一次验证，并第一次全面的分析了牛的颗粒细胞与未成熟卵母细胞的蛋白组。

2010年，Peddinti等［35］利用差异洗涤分馏和多维色谱-串联质谱技术对牛的颗粒细胞与未成熟卵母细胞进行了蛋白质组研究。研究结果显示，颗粒细胞共鉴定得到1 247种蛋白，而未成熟卵母细胞共鉴定得到811种蛋白，两者表达差异显著的蛋白一共371种。经过分析可知，颗粒细胞中的蛋白主要参与代谢、信号传导以及分子运输等过程。该实验结果证明了颗粒细胞可为卵母细胞传递特异的信号用以维持卵母细胞的生长以及成熟。

2012年，刘振方等［36］利用2-DE研究了成熟前后的水牛卵母细胞差异蛋白质组。实验结果检测出300种蛋白以及差异蛋白质共27种，并有8种蛋白被鉴定，其中RREB1、NMP2、HSC71、α-IgG以及HSP60在MII期表达上调，MVP、GEMIN8以及GCNT2则在MII期表达下调，为水牛卵母细胞成熟发育提供了潜在的标记物。

2015年，陈富美等［37］利用LC-MS/MS研究了GV期和MII期的水牛卵母细胞蛋白表达谱。实验结果共检测出574个蛋白，其中有476个蛋白组成细胞成分，487个蛋白有明确的分子功能，有490个蛋白跟生物学进程有关，为此后研究水牛蛋白质组学奠定了基础。

2016年，陈凌声等［38］利用2-DE与聚丙烯酰胺凝胶电泳联合反相液相色谱-串联质谱技术对水牛GV期与MII期的卵母细胞蛋白质组进行了研究。实验结果分别鉴定得到647个蛋白（GV期）与570个蛋白（MII期），其中两时期共有蛋白为414个。经分析发现共有蛋白主要集中在能量代谢通路上，可能是为保证完成减数分裂的原因，而需要在成熟过程中具有一个较高的能量代谢水平。GV期阶段特异性蛋白主要存在蛋白酶体、氧化磷酸化和核糖体等KEGG通路上，在细胞成熟过程中蛋白酶体发挥着举足轻重的作用，且在GV期的细胞蛋白合成水平和氧化磷酸化都较高。MII期阶段特异性蛋白主要参与氨基糖代谢与DNA复制等KEGG通路，可能是为后续生长发育做准备。该实验为研究水牛卵母细胞奠定了基础。

同年，Chen等［39］利用iTRAQ（Isobaric tags for relative and absolute quantitation）技术对GV期与MII期的水牛卵母细胞的蛋白质谱进行了研究。实验结果鉴定出3 763个蛋白，是目前得到的最大的水牛卵母细胞蛋白组。其中GV期卵母细胞与发育成熟的MII期的卵母细胞差异表达的蛋白有173个，发育成熟与没能力成熟的卵母细胞差异表达的蛋白有146个。而且发育成熟的卵母细胞表达上调的蛋白同GV期和没能力成熟的卵母细胞相比，主要参与染色体分配、蛋白运输以及氧化磷酸化等。此实验为后续了解水牛卵母细胞潜在的分子机理提供了有价值的数据，而且所得到的蛋白也可作为水牛卵母细胞体外成熟发展的潜在标志。

3 牛着床前胚胎蛋白质组在发育过程中的研究进展

非常有限的牛着床前胚胎材料使得关于牛着床前胚胎蛋白组的研究结果屈指可数，但早在1989年就有人开始了牛着床前胚胎的研究。Frei等［40］利用1-DE技术与荧光显影对牛的卵母细胞和着床前胚胎的蛋白质合成进行了分析。实验发现着床前胚胎在8-16细胞发育阶段的蛋白质合成模式变化显著，且着床前胚胎的蛋白质合成效率在卵母细胞到8-细胞期间平缓的下降，随后再逐渐的上升至囊胚阶段。研究人员后又利用放射性元素标记尿苷来研究RNA的合成效率，结果证明蛋白质合成受母源mRNA的调控直至8-细胞阶段，后面的8-16细胞阶段转由合子基因调控蛋白质合成，因此，该试验证实了8-16细胞阶段合子基因转录被启动。

2006年，Massicotte等［33］利用2-DE技术对牛着床前胚胎蛋白质表达模式进行了研究。实验鉴定得到2-细胞期蛋白质有291种，其中阶段特异性蛋白70种；4-细胞期蛋白质有373种，其中阶段特异性蛋白83种；8-细胞期蛋白质有252种，其中阶段特异性蛋白28种。三时期共有蛋白质有123种，且这123种蛋白质被看作候选的母源性蛋白。后面研究者利用ALDI-TOF-MS技术鉴定出10种蛋白，其中大多数在卵巢或者卵子中已被研究过，但是存在卵母细胞中的E-FABP蛋白是新的候选母源性蛋白，且该蛋白是第一次被研究。此研究为母源-胚胎转变过程中蛋白表达模式研究提供了有价值的研究数据，同时进一步揭示了母源性蛋白质的分子机理。

2012年，Demant［41］利用iTRAQ技术对不同发育阶段牛胚胎的差异表达蛋白进行了研究。实验结果发现，2-细胞与桑椹胚差异表达的蛋白有28种，且其中的胰岛素生长因子2（Insulin growth factor 2，IGF2）mRNA结合蛋白与Y-box结合蛋白（Y-box binding protein 2，YBX2）等在2-细胞与桑葚胚中表达存在丰度差异，在桑椹胚和囊胚中跟翻译与生物合成过程有关的蛋白质表达差异显著。该研究为胚胎基因组激活的分子机制奠定了基础。

4 结语

牛为单胎动物，繁殖周期长，自然繁殖力低。研究牛的繁殖性能以提高牛群的质量及数量进而满足市场的需求，就必定会研究其卵母细胞。虽然国内外许多研究者从重要基因、基因组及转录组等多个层面对牛的卵母细胞及着床前胚胎进行了大量研究，但是对牛的卵母细胞与着床前胚胎的蛋白质组进行研究较少。

目前在研究牛卵母细胞和着床前胚胎的蛋白质组方面仍存在许多的问题。首先，牛卵母细胞及胚胎材料有限，且收集细胞较困难。其次，目前牛的蛋白质数据库尚不完善。第三，大量的低丰度蛋白质不易被检测到等。

随着科学技术的发展，已实现微量甚至单个细胞蛋白质组的研究，为牛的微量甚至单个卵母细胞或胚胎蛋白组研究奠定了基础［42］。此外，利用先进的技术研究成熟前后卵母细胞或不同时期着床前胚胎等的蛋白质组，挑选跟卵母细胞成熟相关的标志蛋白，将有利于理解牛卵母细胞成熟、体外受精以及着床前胚胎发育，进而提高卵母细胞的成熟率以及胚胎的发育率等。

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Advances on the Proteomics of Bovine Oocyte and Preimplantation Embryo Development

PU Li-ping CHEN Fu-mei ZHAO Xiu-ling WANG Huan-jing HOU Zhen XU Zhuang-zhuang ZHANG Peng-fei ZHANG Ming
（State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources，Animal Reproduction Institute，Guangxi University，Nanning 530004）

Proteomics，as a high-throughput method for displaying protein expression profiles of specific biological processes in a panoramic view，is being applied in more and more research fields. Bovine oogenesis and development of preimplantation embryo are inseparable from a series of changes in protein，thus the molecular mechanism of bovine oocyte maturation and embryo development can be investigated by proteomics. By establishing the proteomic expression profiles of oocytes before and after maturation as well as preimplantation embryos in different stages，we obtained marker proteins related to oocyte maturation and further validated and analyzed these markers，benefiting to understand the molecular mechanism of bovine oocyte maturation，in vitro fertilization and preimplantation embryo development. It lays a foundation for improving the mature rate of bovine oocyte，the rate of embryonic development and the rate of bovine reproduction. In this paper，the progress of proteomics in the bovine oocytes and development of preimplantation embryos was reviewed from the methods of studying proteomics，such as two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，chromatography and mass spectrometry. To provide reference for further study of bovine oocyte and preimplantation embrv.

proteome；oocyte；preimplantation embryo

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0404

2017-05-18

国家自然科学基金项目（31460603），广西水牛遗传繁殖重点实验室开放课题（SNKF-2015-02）

濮黎萍，女，硕士研究生，研究方向：动物蛋白质组学；E-mail：1171728501@qq.com

张明，女，博士，研究方向：胚胎技术，动物蛋白质组学；E-mail：mingzhang@gxu.edu.cn

（责任编辑 李楠）