低温等离子体对丝素纤维人工血管材料蛋白吸附性能的影响

秦金桥，余邵婷，程志，王璐，关国平

东华大学纺织学院纺织面料技术教育部重点实验室(上海，201620)

低温等离子体对丝素纤维人工血管材料蛋白吸附性能的影响

秦金桥，余邵婷，程志，王璐，关国平

东华大学纺织学院纺织面料技术教育部重点实验室(上海，201620)

丝素纤维是一种天然蛋白质纤维，具有良好的生物相容性，在生物医用材料领域具有广阔的应用前景。该文分别采用氦气和氧气低温等离子体处理丝素纤维人工血管材料，探究不同等离子体对材料表面形貌、亲水性、力学性能及蛋白吸附性能的影响。结果表明，两种等离子体均可对丝素纤维表面产生刻蚀作用，且氧气等离子体的刻蚀作用较强。然而，氦气等离子体对改善材料表面亲水性效果较优。拉伸断裂强度结果显示，氧气等离子体对丝素纤维人工血管材料的力学性能损伤较大。蛋白吸附试验结果显示，两种等离子体均能降低血浆蛋白在材料表面的吸附，且氦气等离子体处理的效果更为显著。本研究结果表明，采用氦气等离子体处理丝素纤维人工血管材料，可能更有助于减少血细胞在材料表面的粘附，从而降低形成血栓的风险，且对材料力学性能影响不大。

低温等离子体； 丝素纤维； 人工血管； 蛋白吸附； 亲水性； 力学性能

0 引言

蚕丝是天然蛋白质纤维，由两根丝素纤维和外覆的丝胶蛋白组成。丝素纤维有着良好的韧性和强度，同时具备良好的生物相容性和生物可降解性，在生物医用材料领域受到越来越多的关注，如外科手术缝合线、药物缓释载体和可吸收组织工程支架等[1-4]。丝素纤维作为人工血管材料的研究，也日益增加[5-7]。然而，丝素纤维人工血管材料的血液相容性尚不理想，与血液直接接触时可能会导致凝血和血栓的形成[8-11]。但是，改性后的丝素纤维人工血管在移植到小鼠腹主动脉一年后的通畅率可以保持在85%，远高于ePTFE人工血管[12]。因此，通过改性丝素纤维人工血管材料表面来提高其血液相容性具有重要意义。

低温等离子体处理技术是一种环境友好的干式表面处理技术，常被用于改善材料的润湿性[13]、界面粘附性[14]、亲水性[15-16]等。研究表明，无论是反应性气体(如O2、N2)等离子体[17-18]，还是惰性气体(如Ar、He)等离子体[19-20]，均能改善材料的血液相容性。反应性气体等离子体可直接在材料表面引入活性基团(如-OH、-COOH、-NH2等)，同时使材料表面发生分解，产生刻蚀，从而改变材料表面的血液相容性。惰性气体等离子体则是通过对材料表面的轰击作用，使大分子链发生断裂和分解而形成小分子碎片，在材料表面产生大量的自由基，进而对材料的血液相容性产生影响[21]。

因此，本文使用He和O2两种气体等离子体处理了丝素纤维人工血管材料表面，探究了气体类型、处理时间对材料表面形貌、亲水性、力学性能和蛋白吸附性能的影响，分析了等离子体引起材料性能改变的物理及化学机制。旨在通过等离子体处理丝素纤维人工血管材料，降低材料表面的蛋白吸附量，提高丝素纤维人工血管材料的血液相容性。

1 实验部分

1.1 实验材料和仪器

丝素纤维人工血管材料： 蚕丝1/1平纹，径密380根/10 cm，纬密580根/10 cm，克重240 g/m2。无水碳酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司)，PBS(Gibco，英国)。HD-300型冷等离子体处理仪(江苏常州中科常泰等离子体科技有限公司)，OCA15EC型接触角测量仪(Dataphysics INSTRUMENTS GMBH,德国)，TM3000型扫描电子显微镜(日本日立公司)，D/max-2550 PC型X射线衍射仪(日本理学公司)，DHG-9055A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，Nicolet6700型傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Fisher公司)，FA-1004型电子天平(上海天平仪器厂)，YG026MB型多功能电子织物强力机(温州方圆仪器有限公司)，TU-1901型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 丝素纤维人工血管材料的预处理

丝素纤维人工血管材料在0.5% Na2CO3水溶液中煮沸脱胶30 min，浴比为1:100，重复3次。用去离子水冲洗3次，每次10 min。再放入电热鼓风干燥箱中40 ℃烘干，得到丝素纤维人工血管材料(Silk Fibroin Fiber Fabric，简记为SFFF)。

1.2.2 低温等离子体处理

将预处理后的丝素纤维人工血管材料置于等离子体处理室中，抽真空后通入气体(He或O2)，使处理室内的气压维持在20 Pa，然后接通电源开始放电，并计时。功率设定为50 W，处理时间分别为60 s、180 s和300 s。将经过氦气和氧气等离子体处理的丝素纤维人工血管材料分别记为He-SFFF、O2-SFFF。

1.2.3 蛋白吸附试验

配制不同浓度的胎牛血清(FBS)溶液，并使用紫外分光光度计在280 nm波长下测试不同浓度FBS溶液的吸光度值，绘制FBS浓度-吸光度值标准曲线。将样品裁剪成直径1.2 cm的圆片，然后浸泡在75%乙醇溶液中灭菌1 h，再在PBS缓冲液中浸泡2 h，除去残留的乙醇。将灭菌后的样品放入24孔培养板中，并在每孔中加入1 mL浓度为3.5 mg/mL的胎牛血清(FBS)溶液。在37 ℃恒温箱中放置24 h。使用紫外分光光度计在280 nm波长下测试吸附实验前后FBS溶液吸光度的变化，再对照浓度-吸光度标准曲线得到吸附前后的溶液浓度[22]。

1.3 测试方法

1.3.1 扫描电子显微镜(SEM)

试样经喷金后，使用TM3000型SEM扫描电子显微镜观察丝素纤维人工血管材料处理前后的表面形态，测试电压为15 kV。

1.3.2 傅里叶变换红外光谱(FTIR)

采用全反射法红外光谱测试，将处理后的丝素纤维人工血管材料在Nicolet6700型傅里叶变换红外光谱仪上进行测试，扫描范围为500 cm-1～4 000 cm-1。

1.3.3 结晶度测试

使用D/max-2550 PC型X射线衍射仪，测试处理前后丝素纤维人工血管材料结晶度的变化。衍射源为Cu/K-α1，电压为40 kV，电流为200 mA，扫描速度为3°/min，扫描范围为5°～60°。

1.3.4 亲水性测试

采用OCA15EC型水接触角测量仪，气泡捕获法测量丝素纤维人工血管材料经等离子体处理前后水接触角的变化，气泡体积3 μL，每个试样表面分别选取3个不同位置进行测量，最后取平均值。

1.3.5 拉伸断裂强度

采用拆边纱测试法，试样尺寸为150 mm×20 mm，夹持长度为100 mm，拉伸速率为100 mm/min，预加张力为0.5 N。

1.4 数据表达及统计分析

2 结果与讨论

2.1 丝素纤维人工血管材料表面形貌

等离子体处理前后丝素纤维的SEM图，见图1。由图1可以看出，未处理丝素纤维表面较为平整、光滑，而经过He或O2等离子体处理后，丝素纤维表面沿纤维轴向均出现了原纤状剥离物，并且在剥离处有沟槽形成，纤维及织物表面粗糙度增加。且随着处理时间的增加，表面原纤状剥离和沟槽结构也呈现增多的趋势。然而，与He等离子体处理结果相比，O2等离子体处理后的剥离物和沟槽的尺寸大且数量较多，处理后的丝素纤维表面刻蚀效果更明显。

出现这种现象的原因是，气体分子在电场的作用下发生电离，产生大量的高能粒子对纤维表面进行轰击，使材料结构疏松的部分产生剥离。He为惰性气体，作用较为温和[23]。而O2电离产生的极性等离子体具有更高的能量，轰击作用更强，而且对纤维表面具有较强的氧化作用，能使原来结构紧密的部分也因氧化而疏松，并逐渐被刻蚀下来[24]。因而O2等离子体对丝素纤维的刻蚀作用更加明显。

(a) untreated SFFF,(b) He-60 s,(c) He-180 s,(d) He-300 s,(e) O2-60 s,(f) O2-180 s,(g) O2-300 s

2.2 丝素纤维人工血管材料红外光谱结果

等离子体处理300 s后丝素纤维人工血管材料的红外光谱结果，见图2。He和O2等离子体处理后的红外光谱曲线变化不明显，说明材料结构并无发生较大的变化。但是，在波数1 630 cm-1处和3 290 cm-1处，分别对应C=O和O-H的不对称伸缩振动峰，振动吸收峰的强度均有所增大，说明两种气体等离子体处理后丝素纤维表面羧基和羟基等亲水性官能团的含量都有所增加[25-27]。O2等离子体处理后，丝素纤维酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的谱带β折叠构象峰分别由处理前的1 630 cm-1、1 520 cm-1变为处理后的1 628 cm-1、1 515 cm-1，向小波数方向移动,并有增强的趋势，说明丝素纤维内部构象有由无规则卷曲向β折叠转化的趋势[21]。

图2 等离子体处理前后丝素纤维人工血管材料的红外光谱结果

2.3 X射线衍射结果

分别对等离子体处理前后丝素纤维人工血管材料进行X射线衍射分析，结果见图3。经过He和O2等离子体处理300 s后，X射线衍射曲线的形状及特征峰的位置与处理前非常相似，说明经过等离子体处理后材料的主体结构和晶格结构基本无变化。从衍射峰的强度来看，He等离子体处理后材料的衍射强度与未处理材料的衍射强度接近，而O2等离子体处理后的衍射峰强度有所减小。这在一定程度上可以说明，O2等离子体处理后丝素纤维的结晶度有所下降[28]，而He等离子体处理对丝素纤维结晶度的影响不大。出现这种现象的原因是由于O2等离子体的刻蚀作用使得纤维的结晶结构发生部分氧化和降解，造成了结晶度的下降[29]。He等离子体处理作用较弱，对结晶结构的影响也较小。

图3 等离子体处理前后丝素纤维人工血管材料的XRD图谱

2.4 亲水性测试

He和O2等离子体处理前后丝素纤维人工血管材料的水接触角结果，见图4。未处理丝素纤维材料表面接触角为31.9°，He等离子体处理后，材料表面水接触角随着处理时间的增加逐渐减小。处理60 s时为26°，180 s时为24.6°，300 s时为23.1°，说明He等离子体处理能够提高丝素纤维表面的亲水性。O2等离子体处理丝素纤维人工血管材料60 s后接触角大小为32.1°，与未处理材料的水接触角之间无显著差异。处理180 s后，水接触角开始减小。处理300 s时，水接触角为27.5°，也随处理时间的增加而呈减小趋势。在处理相同时间时，He等离子体处理后的水接触角均小于O2等离子体处理组，说明He等离子体处理对丝素纤维亲水性的提高更加明显。

图4 等离子体处理时间对丝素纤维人工血管材料接触角的影响

Sliwinska[30]研究发现，材料表面的接触角会随着材料表面粗糙度的增加而增大。而根据“Cassie理论”[31-32]，接触角除了与材料的亲疏水性有关外，还与固体材料表面粗糙度有关。对于接触角>90°的疏水性表面，表面粗糙度的增加可以使表观接触角变大。而对于接触角<90°的亲水性表面，表面粗糙度的增大反而会使表观接触角变小。因此，本研究中O2等离子体处理后丝素纤维(接触角<90°)粗糙度增加，其接触角测量值有增大趋势。另一方面，O2等离子体的强氧化作用使材料表面化学成分改变，亲水性含氧基团数量增加，减小了材料表面接触角。然而，He等离子体处理后，丝素纤维人工血管材料表面形态变化较小，粗糙度变化对水接触角影响较小，其表面接触角随材料表面亲水基团的增加而减小。因此，在相同处理条件下，出现了O2等离子体处理的丝素纤维人工血管材料的接触角小于He等离子体处理组的现象。

2.5 拉伸断裂强力

等离子体处理时间对丝素纤维人工血管材料的拉伸断裂强力影响，见图5。如果未处理的丝素纤维材料的拉伸断裂强力为80.3 N。经过He和O2等离子体分别处理60 s后，拉伸断裂强力分别为76.8 N和68.5 N，分别下降了4.4%和14.7%。处理180 s后，拉伸断裂强力分别为73.2 N和63.0 N，分别下降了8.8%和21.5%。处理300 s后，强力分别为70.2 N和59.5 N，分别下降了12.6%和25.9%。可以看出，He和O2两种等离子体均会造成丝素纤维人工血管材料的力学性能下降。且随着处理时间的增加，拉伸断裂强力呈现逐渐降低的趋势。与O2等离子体处理结果相比，He等离子体处理后的材料的拉伸断裂强力损失较小。尽管如此，本研究中的丝素纤维材料的力学性能仍然高于商用膨体聚四氟乙烯(ePTFE)人工血管的拉伸断裂强力[33]。说明处理后的丝素纤维材料能够满足人工血管临床力学性能的需要。

图5 等离子体处理时间与丝素纤维人工血管材料拉伸断裂强力的关系

2.6 FBS蛋白吸附

2.6.1 FBS蛋白浓度与吸光度标准曲线绘制

不同浓度FBS蛋白溶液的吸光度值与吸光度标准曲线，见图6。在280 nm波长下，FBS蛋白溶液浓度对吸光度的回归直线方程如式(1)所示。

y=0.851 41x-0.004 663

(1)

其中，y为吸光度，x为FBS蛋白溶液的浓度mg/mL。R2=0.998 25，说明线性回归关系十分明显，即拟合直线可以很好地用于未知浓度FBS蛋白溶液的测量。

图6 FBS蛋白溶液浓度-吸光度标准曲线

2.6.2 等离子体处理对材料表面FBS蛋白吸附的影响

经He、O2等离子体处理得到的丝素纤维人工血管材料吸附FBS中蛋白质的情况，见图7。单位质量未处理丝素纤维材料表面的FBS蛋白吸附量约为17 mg/g。He、O2等离子体处理60 s后吸附量分别为11.4 mg/g和14.5 mg/g，分别减少了33%和14.7%； 处理180 s后的吸附量分别为11.1 mg/g和13.8 mg/g，分别减少了34.7%和18.8%； 处理300 s后吸附量分别为10.9 mg/g和13.3 mg/g，分别减少了35.9%和21.8%。这就表明，两种等离子体处理60 s后，FBS蛋白的吸附量均有明显的减少。但随着处理时间的增加，蛋白吸附量不再发生明显变化，说明增加处理时间对FBS吸附量的影响不大。

然而，He等离子体处理组蛋白吸附量的减少程度要大于O2等离子体处理组。根据M. Fazley Elahi[21]和Anna E[34]等人的研究，血浆蛋白在材料表面吸附量越少，材料的血液相容性越好，越不易形成血栓。因此，He、O2两种等离子体处理丝素纤维人工血管材料，均具有提高血液相容性的潜力，而He等离子体处理对血液相容性的改善效果要更明显。

材料表面的蛋白吸附受化学成分、表面形貌、粗糙度、亲疏水性和表面电荷等因素影响[13]。蛋白质主要通过与材料表面的非极性基团发生作用吸附到材料表面，因此减少材料表面非极性基团会造成蛋白质在材料表面的吸附量减少[35]。在本研究中，He、O2等离子体处理均提高了丝素纤维人工血管材料表面的亲水性，即疏水性下降，因此造成了蛋白吸附量的下降。与亲水性测试结果相一致，这就解释了在相同处理条件下，O2等离子体处理材料的蛋白吸附量要大于He等离子体处理组。

图7 等离子体处理前后丝素纤维人工血管材料表面FBS蛋白吸附结果

3 结论

本文分别采用He和O2两种等离子体处理丝素纤维人工血管材料表面，探究了He及O2等离子体对材料表面蛋白吸附性能的影响。同时，对材料表面形貌、亲水性、内部结构、拉伸断裂强力等进行了分析和比较。O2等离子体对丝素纤维表面形貌的改变更为明显，材料表面产生了明显刻蚀，而且含氧基团数量增加，结晶度下降，力学性能下降明显。相对而言，He等离子体对丝素纤维人工血管材料结构和性能的影响较小。但是，两种气体等离子体处理均能减少血浆蛋白在丝素纤维人工血管材料表面的吸附量，而He等离子体处理效果更显著。这就说明，两种等离子体处理丝素纤维人工血管材料均具有提高材料血液相容性的潜力。但是，综合考虑力学性能和蛋白吸附性能的话，He等离子体处理对材料的力学性能损伤更小，而对血液相容性的提高更显著。当然，本研究结果还比较初步，对于血液相容性的评价还需要进行体外和体内实验进行进一步验证。

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Effects of Low-temperature Plasma on Protein Adsorption of Silk Fibroin Fiber Fabric for Vascular Graft

QIN Jinqiao,YU Shaoting,CHENG Zhi,WANG Lu,GUAN Guoping

Key Laboratory of Textile Science and Technology,Ministry of Education,College of Textiles,Donghua University (Shanghai,201620)

Silk fibroin fiber is natural fiber of protein which has satisfactory biocompatibility and promising potential in a wide range of utilization in biomaterial field. In present work,both He and O2plasma were used to treat silk fibroin fiber fabrics for vascular grafts,then the effects of the plasma on the morphology,the hydrophilicity,the mechanical properties and the protein adsorption were studied. The results suggested that both plasma treatments could give rise to etching on the fabrics,and the etching effect of O2plasma treatment was more obvious. However,the hydrophilicity of the fabric after He plasma treatment was significantly improved. Moreover,the tensile force at break of the fabric after O2plasma treatment decreased more than that of the fabric after He plasma treatment. Furthermore,the protein adsorption of the fabrics declined after both plasma treatments,but the amount of protein adsorbed on the surface of the fabrics treated by He plasma showed lower than that of the fabric after O2plasma treatment. In summary,He plasma might be better than O2plasma for decreasing the adsorption of blood cells onto the fabrics and the risk of thrombosis in vivo and maintaining the satisfactory mechanical property.

low-temperature plasma,silk fibroin fiber,vascular graft,protein adsorption,hydrophilicity,mechanical property

10.3969/j.issn.1674-1242.2017.01.001

中央高校基本科研业务费专项(2232015A3-02)；上海市教育委员会科研创新项目(ZX201503000017)

秦金桥，硕士，从事生物医用纺织品研究，E-mail:qinjinqiao007@163.com

关国平，教授，E-mail:ggp@dhu.edu.cn

TS101.4

A

1674-1242(2017)01-0001-07

2016-10-24)