响应面法优化白薇抑菌物质超声提取工艺

彭 旋,万春鹏,陈玉环,陈楚英,陈金印,*

(1.江西省果蔬采后处理关键技术与质量安全协同创新中心,江西农业大学农学院,江西南昌 330045; 2.江西省果蔬保鲜与无损检测重点实验室,江西农业大学农学院,江西南昌 330045)

响应面法优化白薇抑菌物质超声提取工艺

彭 旋1,2,万春鹏1,2,陈玉环1,2,陈楚英1,2,陈金印1,2,*

(1.江西省果蔬采后处理关键技术与质量安全协同创新中心,江西农业大学农学院,江西南昌 330045; 2.江西省果蔬保鲜与无损检测重点实验室,江西农业大学农学院,江西南昌 330045)

为研究白薇抑菌物质的提取工艺条件,实验以白薇为原料,意大利青霉菌为供试菌,抑菌圈直径为指标,采用超声波辅助浸提白薇抑菌物质。在单因素实验基础上,研究响应面分析法(Response Surface Methodology,RSM)优化超声波辅助提取白薇抑菌物质的工艺参数。结果表明:白薇抑菌物质的最佳提取工艺为乙醇浓度50%,浸提时间2 h,液料比31,浸提温度69 ℃,在此条件下,白薇提取液对意大利青霉抑菌圈直径达到40.58 mm,与理论最优值40.81 mm接近。

白薇,响应面法,超声波提取,意大利青霉

白薇(CynanchumatratumBunge)为萝藦科鹅绒藤属植物直立白薇或蔓生白薇的干燥根茎,具有清热凉血、利尿通淋、解毒疗疮的功效[1],常用于温邪伤营发热、阴虚发热等症状的治疗。国内外对白薇的研究目前主要集中在化学成分和药理作用方面。对白薇化学成分的分析发现,白薇含有C21甾体皂苷、白薇素、挥发油、强心苷等成分[2],其中主要为C21甾体皂苷[3-4]。对白薇药理作用的研究发现,C21甾体皂苷具有抗炎、镇痛、退热和抗肿瘤等药理作用[5-7]。陈楚英等人[8]研究发现白薇对柑橘采后致病菌意大利青霉(Penicilliumitalicum)具有良好抑制效果,表明白薇含有意大利青霉的抑菌物质。通过一定的提取方法和工艺可以获得抑菌物质,传统提取方法有水蒸气蒸馏法[9]和有机溶剂提取法[10],但水蒸气蒸馏法温度较高,会导致抑菌物质受热分解,提取率较低,而有机溶剂提取法存在溶剂残留问题;超声波具有强烈振动、强化的空化效应和搅拌作用,可以加快抑菌物质的浸出,大大缩短提取时间,因而被广泛用于药用植物活性成分的提取[11]。

中药有效成分的提取往往受多种因素及其交互作用的影响,传统的正交设计得不到有关因子和响应值的回归方程,而均匀设计没有考虑全部交互作用,结果不稳定;响应面分析法采用多元二次回归方程拟合因子和响应值之间的函数关系,能研究因子间的交互作用,且实验次数少、周期短、精度高,优势突出[12]。因此,本实验以抑菌圈直径为响应值,采用响应面分析法优化白薇抑菌物质超声波提取工艺,选出最佳工艺参数,为工业生产提供理论依据以及为后续白薇抑菌物质分离鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白薇 江西省樟树市华丰药业有限公司,粉碎,过40目筛,药粉常温保存备用;意大利青霉菌 江西农业大学植物病理实验室提供;无水乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、石油醚、葡萄糖、琼脂 均为市售分析纯药剂。

SHZ-D(Ⅲ)循环水真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司,ROTAVAPOR R-3旋转蒸发仪 瑞士BUCHI公司,AUY220电子天平 日本岛津公司,KQ-500B超声波清洗机 昆山超声仪器有限公司,YXQ-LS-70A立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司,MIR-254恒温培养箱 日本三洋,HS-1300U超净工作台 苏静集团苏州安泰公司,FW100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 意大利青霉菌种活化及孢子悬浮液的制备 在无菌环境中挑取意大利青霉白色菌丝接种至PDA培养基上,放置28 ℃恒温培养箱培养一周后(菌种活化),用无菌水将意大利青霉菌洗入三角瓶中,用普通玻璃珠将孢子打散,过滤,将滤液充分摇匀制成孢子悬浮液,血球计数板计数,使菌悬液孢子浓度为108个/mL[13]。

1.2.2 白薇提取液抑菌效果的测定 采用杯碟法[14]测定白薇提取液的抑菌效果。无菌环境下,往未凝固的100 mL PDA培养基中加入1 mL意大利青霉菌悬液,摇匀倒入平板。待培养基凝固后,吸取200 μL浓度为1 g/mL的白薇提取液于牛津杯中,重复三次。将平板放置28 ℃的恒温培养箱中培养2 d,采用十字交叉法测量抑菌圈直径,抑菌圈直径越大,说明抑菌效果越好,提取液中抑菌物质越多。

1.2.3 提取溶剂的选择 称取5 g白薇药粉置于6个三角瓶中,而后分别加入100 mL的蒸馏水、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚溶液,用封口膜封住瓶口,常温下超声波(40 kHz)辅助浸提2 h。将浸提液抽滤、旋转蒸发仪浓缩(45 ℃、-0.09 MPa)制成1 g/mL各提取溶剂的白薇提取液,测定其对意大利青霉的抑菌效果。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 乙醇浓度对白薇提取液抑菌效果的影响 称取5 g白薇药粉置于5个三角瓶中,而后分别加入液料体积质量比(液料比)为20的30%、40%、50%、60%和70%乙醇溶液,用封口膜封住瓶口,置于40 ℃温度下超声波辅助浸提1.5 h。将浸提液抽滤、浓缩制成1 g/mL的白薇提取液,测定其对意大利青霉的抑菌效果。

1.2.4.2 浸提时间对白薇提取液抑菌效果的影响 称取5 g白薇药粉置于5个三角瓶中,而后加入液料比为20的50%乙醇溶液,用封口膜封住瓶口,置于40 ℃温度下,分别超声波辅助浸提1、1.5、2、2.5和3 h。浸提结束后抽滤、浓缩制成1 g/mL的白薇提取液,测定其对意大利青霉的抑菌效果。

1.2.4.3 液料比对白薇提取液抑菌效果的影响 称取5 g白薇药粉置于5个三角瓶中,而后分别加入液料比为10、20、30、40和50的50%乙醇溶液,用封口膜封住瓶口,置于40 ℃温度下超声波辅助浸提2 h。将浸提液抽滤、浓缩制成1 g/mL的白薇提取液,测定其对意大利青霉的抑菌效果。

1.2.4.4 浸提温度对白薇提取液抑菌效果的影响 称取5 g白薇药粉置于5个三角瓶中,而后加入液料比为30的50%乙醇溶液,用封口膜封住瓶口,分别置于40、50、60、70、80 ℃温度下,超声波辅助浸提2 h。浸提结束后抽滤、浓缩制成1 g/mL的白薇提取液,测定其对意大利青霉的抑菌效果。

1.2.5 响应面优化提取工艺的设计 综合乙醇浓度、浸提时间、液料比和浸提温度这四个单因素实验结果,根据Design Expert软件中Box-Behnken的中心组合设计原理,采用响应面法设计了4因素3水平的实验对白薇抑菌物质的提取工艺条件进行优化,以意大利青霉为指示菌,抑菌圈直径大小为响应值,实验重复三次。实验因子和水平见表1。

表1 Box-Benhnken设计因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken experimental design

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2003制图、SPSS 17.0对单因素实验数据进行Duncan多重比较分析以及Design Expert 8.0.6.1对响应面实验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

不同提取溶剂的白薇提取液抑菌效果如图1所示,从图1中可以看出,石油醚、氯仿和乙酸乙酯的白薇提取液无抑菌效果,丙酮、乙醇和蒸馏水的白薇提取液有较好的抑菌效果,且蒸馏水和无水乙醇的白薇提取液抑菌效果显著(p<0.05)好于丙酮的白薇提取液。另外,丙酮具有一定的毒性、价格相对较高,又因可以制毒、制爆,受公安部门管制,而蒸馏水的浓缩效率低,从工业生产获取难易程度、安全性、成本及提取效率考虑,实验选用无水乙醇、蒸馏水混合溶液作为提取溶剂。

图1 不同溶剂白薇提取液抑菌效果Fig.1 Antibacterial activity of the cynanchum atratum extracts with different solvents

图2 乙醇浓度(A)、浸提时间(B)、液料比(C)、浸提温度(D)对白薇提取液抑菌效果的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration(A),extraction time(B),liquid-to-material ratio(C), extraction temperature(D)on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

2.2 单因素实验结果

2.2.1 乙醇浓度对白薇提取液抑菌效果的影响 由图2A可知,随着乙醇浓度的升高,白薇提取液的抑菌效果呈现先上升后下降的变化趋势,在乙醇浓度为50%时,抑菌圈直径最大,抑菌效果最好,显著(p<0.05)好于其它浓度。浓度超过50%,抑菌效果减弱,可能是因为一些亲脂性强、醇溶性杂质成分增大浸出,从而影响了抑菌物质的提取率[15]。因此实验将50%的乙醇浓度作为最佳的提取浓度。

2.2.2 浸提时间对白薇提取液抑菌效果的影响 在1～2 h的浸提时间内,随着浸提时间的增加,白薇提取液的抑菌圈直径也随之增大(见图2B)。在浸提时间为2 h时,抑菌效果显著(p<0.05)好于其它浸提时间。当浸提时间超过2 h,抑菌效果随浸提时间的增加而减弱,这可能是后期抑菌物质已充分浸出,而非抑菌成分继续浸出,降低了抑菌物质的提取率[16]。因此实验将浸提时间2 h作为最佳浸提时间。

2.2.3 液料比对白薇提取液抑菌效果的影响 不同液料比的白薇提取液对意大利青霉的抑菌效果见图2C,液料比从10增加到30,白薇提取液的抑菌圈直径逐渐增大,抑菌效果逐渐增强,继续增大液料比,抑菌效果迅速下降,这可能是当扩散平衡后,增加提取剂的量不会再增加抑菌物质的浸出,而非抑菌物质会增加浸出,这样最后浓缩,会降低白薇提取液中抑菌物质的提取率[17]。因此实验将液料比30最为最佳料液比。

2.2.4 浸提温度对白薇提取液抑菌效果的影响 不同浸提温度的白薇提取液对意大利青霉的抑菌效果如图2D所示,在40～70 ℃范围内,白薇提取液的抑菌圈直径随着浸提温度的上升明显增大,浸提温度70 ℃时,白薇提取液的抑菌效果最好,显著(p<0.05)好于其它浸提温度,温度再升高,白薇提取液的抑菌圈直径下降,这可能是由于抑菌物质的结构被破坏[18]。因此实验将浸提温度70 ℃作为最佳浸提温度。

2.3 响应面法优化白薇抑菌物质的超声波提取工艺

2.3.1 响应面实验设计方案与结果 按表1的设计方案,实验结果如表2。

表2 响应面实验设计方案与结果Table 2 Experimental design and results of the Box-Benhnken test

2.3.2 模型的建立及显著性检验 用Design Expert 8.0.6.1软件对表2中的数据进行多元回归拟合,得到抑菌圈直径(Y)对乙醇浓度(A)、浸提时间(B)、液料比(C)和浸提温度(D)的模型回归方程:

Y=40.77-0.063A+0.33B+0.11C-0.21D+0.53AB+0.72AC+0.94AD-0.69BC+0.031BD-1.57CD-1.05A2-1.64B2-1.47C2-1.62D2(R2=0.9652)

从方程可以看出响应值与实验因子之间不是简单线性关系,而是呈二次抛物线关系。方程中存在AB、AC、AD、BC、BD、CD项,说明各因子间存在交互作用,此外方程的决定系数R2=0.9652,表明96.52%的数据可用此方程解释,说明该模型与实际实验拟合良好。

表3 回归模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.3.3 响应面分析与优化 利用Design Expert 8.0.6.1软件,根据回归模型作响应曲面及等高线,结果见图3～图8。若一个响应曲面的坡度非常陡峭,表明形成该坡度曲面的两个因子对响应值有显著影响,从另一个方面表明这两个因子间存在较强的交互作用[20]。另外,等高线近似圆形,表明两个因子对响应值无显著影响,且两个因子间无显著交互作用;而等高线呈椭圆形,表明两个因子对响应值具有显著影响,且两个因子间有显著交互作用[21]。

从图3～图8的响应面图中可以看出,AD项、CD项所形成的曲面比较陡峭,表明AD项、CD项对抑菌圈直径有显著影响。

图3 乙醇浓度与浸提时间对抑菌效果影响的响应面图和等高线图Fig.3 Response surface plot and contour plot for the effects of ethanol concentration and extraction time on antibacterial activity of the cynanchum atratum extracts

图4 乙醇浓度与液料比对抑菌效果影响的响应面图和等高线图Fig.4 Response surface plot and contour plot for the effects of ethanol concentration and liquid-to-material ratio on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

图5 乙醇浓度与浸提温度对抑菌效果影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface plot and contour plot for the effects of ethanol concentration and extraction temperature on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

图6 浸提时间与液料比对抑菌效果影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface plot and contour plot for the effects of extraction time and liquid-to-material ratio on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

图7 浸提时间与浸提温度对抑菌效果影响的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface plot and contour plot for the effects of extraction time and extraction temperature on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

图8 液料比与浸提温度对抑菌效果影响的响应面图和等高线图Fig.8 Response surface plot and contour plot for the effects of liquid-to-material ratio and extraction temperature on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

从图3～图8的等高线图中可以看出,除了BD项的等高线近似圆形,其它交互项的等高线均为椭圆形,表明除了BD项对抑菌圈直径无显著影响,其它交互项对抑菌圈直径均有显著影响,这和模型方差分析的结果一致。

由响应面的分析可知,回归模型存在最大值。通过软件分析计算得出理论最佳提取工艺:乙醇浓度49.66%,浸提时间2.04 h,液料比30.68,浸提温度68.92 ℃,理论抑菌圈直径为40.81 mm。

2.3.4 最优条件的验证 为检验响应面法的可行性,采用最佳提取工艺进行验证,同时考虑实际操作方便,实验以乙醇浓度50%,浸提时间2 h,液料比31,浸提温度69 ℃进行验证,3次重复实验抑菌圈直径平均值为40.58 mm,落于模型理论值的95%置信区间(40.4398～41.1702 mm)内。

3 结论

实验在单因素实验的基础上,采用响应面法对超声波辅助提取白薇抑菌物质的工艺进行优化。实验发现:AC项、AD项、BC项、CD项、A2项、B2项、C2项、D2项对抑菌圈直径有极显著(p<0.01)的影响,AB项对抑菌圈直径有显著(p<0.05)的影响。此外,得到方便实际操作的最佳提取工艺:乙醇浓度50%,浸提时间2 h,液料比31,浸提温度69 ℃,抑菌圈直径为40.58 mm。在此条件下的抑菌圈直径落于模型理论值的95%置信区间内。

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Optimization of ultrasound extraction of antibacterial material fromCynanchumatratumBunge with response surface methodology

PENG Xuan1,2,WAN Chun-peng1,2,CHEN Yu-huan1,2,CHEN Chu-ying1,2,CHEN Jin-yin1,2,*

(1.Collaborative Innovation Center of Post-harvest Key Technology and Quality Safety of Fruits and Vegetables in Jiangxi Province,College of agronomy,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China; 2.Jiangxi Key Laboratory for Postharvest Technology and Nondestructive Testing of Fruits & Vegetables, College of agronomy,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

In order to study the conditions of extracting antibacterial material fromCynanchumatratum,C.atratumwas used as material,the diameter of inhibition zone andPenicilliumitalicumworked as an indicator and bacterial strain in this experiment respectively,beside these ultrasound-assisted extraction was used to antibacterial material fromC.atratum. On the basis of single factor tests,the method of response surface methodology was used to optimize ultrasound-assisted extraction of antibacterial material formC.atratum. The result indicated that the optimal conditions to extract antibacterial material fromC.atratumwere that ethanol concentration was 50%,extraction time was 2 h,liquid-to-material ratio was 31 and extraction temperature was 69 ℃. Under these conditions,the inhibitory effect againstP.italicumbyC.atratumextracts was 40.58 mm,close to the theoretically predicted value of 40.81 mm.

Cynanchumatratum;response surface methodology;ultrasound extraction;Penicilliumitalicum

2016-09-14

彭旋(1991-)，男，硕士研究生，研究方向：果蔬植物源保鲜剂开发与利用，E-mail：pengx1104@163.com。

*通讯作者:陈金印(1962-)，男，博士，教授，研究方向：果蔬采后生理及贮藏技术，E-mail：jinyinchen@126.com。

“十二五”国家科技支撑计划项目 (2012BAD38B03-2)；江西省教育厅科技落地计划项目(111)；江西省“赣鄱英才555工程”(2012)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0176-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.026