中药复方多糖对不同MHCB-LβII基因型鸡血清细胞因子质量浓度的影响

杨红洋，朱晓庆，商云霞，谷新利，郭 晓

(石河子大学 动物科技学院，新疆石河子 832003)

中药复方多糖对不同MHCB-LβII基因型鸡血清细胞因子质量浓度的影响

杨红洋，朱晓庆，商云霞，谷新利，郭 晓

(石河子大学 动物科技学院，新疆石河子 832003)

为探究MHCB-LβII基因多态性对中药复方多糖免疫调节剂量的影响，采用PCR-SSCP方法将500羽黄麻肉鸡按不同MHCB-LβII基因型分组，再将各组分成高、中、低剂量中药复方多糖组和空白对照组。分别于8日龄皮下注射50、25、 12.5 mg/mL中药复方多糖和生理盐水，每只0.2 mL，连续注射7 d，于21、42、56、70日龄各组随机取5只试验鸡，翅静脉采血并分离血清，测定血清中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α的质量浓度。结果显示，中药复方多糖能提高不同MHCB-LβII基因型鸡血清中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α的质量浓度，且高剂量中药复方多糖组中AA基因型个体血清中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ质量浓度高于AB、BB、AC、AD基因型个体的，中剂量中药复方多糖组中AB基因型个体血清中IL-2、IL-4和IFN-γ水平高于AA、BB、AC、AD基因型个体的，低剂量中药复方多糖组中AB基因型个体血清中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ高于AA、BB、AC、AD基因型个体的。表明中药复方多糖对不同MHCB-LβII基因型鸡的最适免疫调节剂量不同。

中药复方多糖；MHCB-LβII基因；细胞因子；鸡

鸡主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)又称B复合体，是16号染色体上一组紧密连锁的高度多态性基因座组成的一个遗传区域，它含有B-F、B-L和B-G 3个亚区[1]。其中，B-L区基因编码MHC II类分子，主要负责递呈外源性抗原，供CD4+T细胞识别，诱导细胞因子的分泌，调节机体抗体产生，影响细胞毒性T细胞活性，参与机体细胞免疫和体液免疫反应[2]。

中草药是中国特有的中医理论与实践相结合的产物，其资源丰富、历史悠久，作用和安全性已被人们认可[3]，作为提高动物免疫力的免疫增强剂被广泛研究并运用到畜禽生产中，以增强畜禽机体抵抗病原的能力。中药有效成分中的多糖是起免疫增强作用的主要成分之一，现已证明很多中药多糖能通过影响白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12)、干扰素(如IFN-α、IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子的生成和表达来调节机体免疫力[4]。也有研究表明多糖不仅能被MHC II分子呈递而被αβ-T细胞的TCR直接或间接识别，激活适应性细胞免疫应答，亦能有效激活B淋巴细胞，诱导特异性抗体的产生[5]。而鸡MHC基因多态性使得不同个体对相同抗原有不同的免疫反应，从而导致机体免疫功能存在个体差异，进而可能影响中药多糖的最适免疫增强剂量。

本研究采用PCR-SSCP方法对试验鸡进行MHCB-LβII基因分型后给予不同剂量中药复方多糖，通过测定各组试验鸡细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α的质量浓度，探讨MHCB-LβII基因多态性对中药复方多糖提高鸡细胞因子含量的最佳使用剂量是否有影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验药物 中药复方由当归、党参、熟地、川芎、山楂、何首乌、淫羊藿、麦冬、茯苓、补骨脂和黄芪11味中药组成，各单味药均购自石河子市医药公司。中药多糖(w=77.10%)由石河子大学化工学院提供。用灭菌蒸馏水将中药复方多糖配制成高剂量(50 mg/mL)、中剂量(25 mg/mL)、低剂量(12.5 mg/mL)3个质量浓度。鸡IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α ELISA检测试剂盒购自上海蓝基生物科技有限公司；血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；PCR Mixture购自宝生物工程(大连)有限公司；新城疫活疫苗购自新疆石河子市八师兽医站；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 试验动物及分组 500羽1日龄黄麻肉鸡购自石河子市孵化场，临床检查健康。根据MHCB-LβII基因第2外显子PCR-SSCP的检测结果分组，再将各组分成高、中、低剂量中药多糖组和空白对照组。分别于8日龄皮下注射50、25、12.5 mg/mL中药复方多糖及生理盐水，每只0.2 mL，连续注射7 d。

所有试验鸡于7日龄进行新城疫疫苗的点眼和滴鼻免疫，27日龄进行二免，并且均采用相同的饲养方法、饲养条件、饲料品质和饲养管理进行常规饲养。

1.1.3 试验仪器 酶标仪(美国热电FC型号)，微量移液器，恒温培养箱，等。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取 分别采集 500羽试验鸡的外周血，按照 DNA 提取试剂盒说明书提取鸡全血DNA，4 ℃冰箱保存，备用。

1.2.2 引物设计 参照GenBank收录的鸡MHCB-LβII基因序列(NC_006103.2)第2外显子信息，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成引物设计和合成，扩增目的条带大小308 bp，上游引物Forward：5′-CTGAATACTGGAACAGCAACG-3′，下游引物Reverse：5′-ACCACTTCACCTCGATCTCC-3′。

1.2.3 PCR扩增 扩增反应总体积为 20 μL：Mix 12 μL，上下游引物各 1 μL，基因组DNA 1 μL，灭菌ddH2O 5 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃复性 30 s ，72 ℃延伸1 min，30 个循环；最后 72 ℃延伸 5 min；4 ℃保存。

1.2.4 PCR-SSCP检测 3 μL PCR产物和8 μL上样缓冲液(V=98%甲酰胺，V=0.025%溴酚蓝，V=0.025%二甲苯青，10 mmol EDTA)混匀后98 ℃水浴变性10 min，立即冰浴10 min。样品在8%非变性聚丙烯酰氨凝胶中电泳。电泳结束后银染，用聚焦成像系统观察结果并照相。

1.2.5 鸡血清IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平检测 每组随机取5只试验鸡，于21、42、56、70日龄翅静脉采血，常规分离血清。按照鸡IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α ELISA检测试剂盒说明书步骤操作，用酶联免疫检测仪测定450 nm波长下的吸光度值(OD值)，并根据ELISA检测试剂盒中标准品浓度及其对应的OD值获得标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值计算出相应样品IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α的质量浓度。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0对试验数据进行方差分析和多重比较。数据均以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 PCR-SSCP基因型检测

对所有DNA样品采用PCR-SSCP方法进行MHCB-LβII基因型检测，发现有5种基因型，即AA基因型(共186羽)、AB基因型(共180羽)、BB基因型(共68羽)、AC基因型(共35羽)、AD基因型(共31羽)(图1)。

2.2 中药复方多糖对不同MHC B-LβII基因型鸡血清中IL-2水平的影响

与空白对照组相比，各剂量中药复方多糖均能提高不同基因型鸡血清中IL-2的质量浓度，但在同一剂量的中药复方多糖组和空白对照组中，不同基因型鸡血清中IL-2的质量浓度不同(表1)。其中，42日龄时，高剂量组AA基因型鸡血清中IL-2的质量浓度显著高于AB、BB、AC、AD基因型(P<0.05)，AB、BB、AC基因型显著高于AD基因型(P<0.05)，56和72日龄时，AA基因型显著高于AB、BB、AC、AD基因型(P<0.05)；中剂量组各日龄鸡AB基因型均显著高于AA、BB、AC、AD基因型(P<0.05)；21日龄时，低剂量组AB基因型显著高于AC、AD基因型(P<0.05)，42和70日龄时，AB基因型显著高于AA、BB、AC、AD基因型(P<0.05)，56日龄时，AB基因型显著高于AA、BB、AC、AD基因型(P<0.05)，AA、BB基因型显著高于AC、AD基因型(P<0.05)；21、42、和56日龄时，空白对照组的AB基因型显著高于AA、BB、AC、AD基因型(P<0.05)，42日龄时，AA基因型显著高于AD基因型(P<0.05)，70日龄时，AB基因型显著高于AD基因型(P<0.05)。

1～3.AC型 Type AC；4～6.BB型 Type BB；7～9.AA型 Type AA；10～12.AB型 Type AB；13～15.AD型 Type AD

图1 部分试验鸡MHCB-LβII基因型的PCR-SSCP检测
Fig.1 PCR-SSCP detection ofMHCB-LβIIgenotype in partial chicken

表1 不同MHC B-LβII基因型黄麻肉鸡血清IL-2的质量浓度Table 1 Mass fraction of serum IL-2 in different MHC B-LβII genotype Huangma chickens pg/mL

注：同一剂量组中，同列数据不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Notes：In the same dose group,different lowercase letters with the same column data was significant difference(P<0.05).The same as follows.

2.3 中药复方多糖对不同MHC B-LβII基因型鸡血清中IL-4水平的影响

与空白对照组相比，各剂量中药复方多糖均能提高不同基因型鸡血清中IL-4的质量浓度，但在同一剂量的中药复方多糖组和空白对照组中，不同基因型鸡血清中IL-4的质量浓度不同(表2)。其中，21日龄时，高剂量组AA基因型鸡血清中IL-4的质量浓度显著高于AB、BB、AC、AD基因型(P<0.05)，其余各日龄AA基因型高于AB、BB、AC、AD基因型，但无显著性差异(P>0.05)；42日龄时，中剂量组的AB基因型显著高于AA、BB、AC、AD基因型(P<0.05)，其余各日龄AB基因型高于AA、BB、AC、AD基因型，但无显著性差异(P>0.05)；21日龄和70日龄时，低剂量组的AB基因型显著高于BB、AC、AD基因型(P<0.05)，42日龄和56日龄时，AB基因型高于AA、BB、AC、AD基因型，但无显著性差异(P>0.05)；空白对照组的各基因型鸡血清中IL-4 质量浓度无明显差异。

表2 不同MHC B-LβII基因型黄麻肉鸡血清IL-4的质量浓度Table 2 Mass fraction of serum IL-4 in different MHC B-LβII genotype Huangma chickens pg/mL

2.4 中药复方多糖对不同MHC B-LβII基因型鸡血清中IL-6水平的影响

与对照组相比，各剂量中药复方多糖均能提高不同基因型鸡血清中IL-6的质量浓度，且中剂量组作用最好，但在同一剂量的中药复方多糖组和空白对照组中，不同基因型鸡血清中IL-6的质量浓度不同(表3)。其中，高剂量组的AA基因型鸡血清中IL-6质量浓度略高于AB、BB、AC、AD基因型，中剂量组的AC基因型略高于AA、AB、BB、AD基因型，低剂量组和对照组的AB基因型略高于AA、BB、AC、AD基因型，3个剂量组和对照组各基因型间鸡血清中IL-6的质量浓度均无显著性差异(P>0.05)。

2.5 中药复方多糖对不同MHC B-LβII基因型鸡血清中IFN-γ水平的影响

与对照组相比，3种不同剂量中药复方多糖均能提高不同基因型鸡血清中IFN-γ的质量浓度，但在同一剂量的中药复方多糖组和空白对照组中，不同基因型鸡血清中IFN-γ的质量浓度不同(表4)。其中，高剂量组的AA基因型鸡血清中IFN-γ的质量浓度略高于AB、BB、AC、AD基因型，中剂量组和低剂量组的AB基因型略高于AA、BB、AC、AD基因型，空白对照组的AA基因型略高于AB、BB、AC、AD基因型，3个剂量组和空白对照组各基因型间鸡血清中IFN-γ的质量浓度均无显著性差异(P>0.05)。

表3 不同MHC B-LβII基因型黄麻肉鸡血清IL-6的质量浓度Table 3 Mass fraction of serum IL-6 in different MHC B-LβII genotype Huangma chickens pg/mL

表4 不同MHC B-LβII基因型黄麻肉鸡血清IFN-γ的质量浓度Table 4 Mass fraction of serum IFN-γ in different MHC B-LβII genotype Huangma chickens pg/mL

2.6 中药复方多糖对不同MHC B-LβII基因型鸡血清中TNF-α水平的影响

3种不同剂量的中药复方多糖均能提高不同基因型鸡血清中TNF-α的质量浓度，但在同一剂量的中药复方多糖组和空白对照组中，不同基因型鸡血清中TNF-α的质量浓度不同(表5)。其中，高剂量组的AD基因型鸡血清中TNF-α的质量浓度高于AA、AB、BB、AC基因型，中剂量组的AA基因型高于AB、BB、AC、AD基因型，低剂量组的AC基因型高于AA、AB、BB、AD基因型，空白对照组的AB基因型略高于AA、BB、AC、AD基因型，3个剂量组和空白对照组各基因型鸡间血清中TNF-α的质量浓度均无显著性差异(P>0.05)。

表5 不同MHC B-LβII基因型黄麻肉鸡血清TNF-α的质量浓度Table 5 Mass fraction of serum TNF-α in different MHC B-LβII genotype Huangma chickens pg/mL

3 讨论与结论

细胞因子是由免疫活性细胞和其他细胞分泌，介导和调节免疫反应以及炎症反应等的一类小分子糖蛋白[6]，它们在促进免疫细胞增殖分化、增强对感染的抵抗力、调节机体的免疫应答和炎症反应等方面发挥着重要作用[7]。其中，IL-2主要由Th1细胞亚群分泌，主要介导机体的细胞免疫[8]；IL-4主要由Th2细胞亚群分泌，主要促进体液免疫[9]；IL-6由淋巴样细胞和非淋巴样细胞产生，它能够促进B淋巴细胞的增殖并促使其合成为分泌型免疫球蛋白的mRNA，增加免疫球蛋白IgM、IgA、IgG的分泌，同时也能促进造血干细胞的生成，在造血和免疫应答调节方面起着至关重要的作用[10-11]；IFN-γ属于Th1型细胞因子，它由Th0和Th1细胞及几乎所有的CD8+T细胞产生[12]，在初级免疫应答中可提高MHCII类分子的表达和细胞的抗原递呈能力，引起记忆性T细胞水平增高[13]，主要促进细胞免疫；TNF-α是一种生物学活性比较广泛的细胞因子，它能够抑制或直接杀死肿瘤细胞，并具有促进细胞分化和增殖的作用[14]。本研究中，高、中、低剂量中药复方多糖均能提高各基因型鸡血清中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平，并且中剂量中药复方多糖的作用最好，说明中药多糖的免疫调节活性不是剂量越大越好，它与西药一样也有其“治疗窗”，一旦达到饱和，无论再增大多少剂量，其效应都不会再增加，有的可能还会产生严重的毒副作用。

鸡MHCB-LβII基因具有丰富的多态性，它使不同个体对相同抗原表现出不同的免疫反应，从而导致机体免疫功能存在个体差异。有研究表明，不同MHCB-LβII基因型个体的淋巴细胞活性、抗体滴度及细胞因子含量不同。Shanaz等[15]比较Bantam、BWLH和WLH鸡种中B2、B15、B2B15、B2B19、B19等 9 种单倍型鸡ND和SRBC抗体滴度，发现MHCB-LβII基因的等位基因 B15和 B19单倍型鸡的ND和SRBC抗体滴度均显著高于其他单倍型，是优势基因型。蔡文博等[16]研究显示，不同MHC单倍型鸡体内Th1型细胞因子和Th2型细胞因子转录水平有差异，虽未达到显著水平，但可以反应出不同MHC基因型鸡的细胞因子表达水平存在一定差异。在本次试验的空白对照组中，不同MHCB-LβII基因型鸡IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α的质量浓度不同。其中，AB基因型鸡血清中IL-2的质量浓度显著高于AA、BB、AC、AD基因型 (P<0.05)，AB基因型鸡血清中IL-4、IL-6和TNF-α的质量浓度略高于其他基因型，AA基因型鸡血清中IFN-γ的质量浓度略高于其他基因型，提示MHCB-LβII基因多态性会引起机体免疫功能的个体差异。

Cobb 等[5]的研究表明，多糖能通过胞吞途径被NO系统降解为小分子质量碳水化合物，被MHC II类分子处理并呈递给T细胞的TCR识别，进而使T细胞活化、增殖并分泌细胞因子，发挥免疫调节作用。因此，MHCB-LβII基因多态性的存在，可能会使中药多糖与TCR受体识别和结合能力不同，进而影响T细胞的活化、增殖及细胞因子的分泌。在本次试验中，当对不同MHCB-LβII基因型鸡给予不同剂量中药复方多糖后，高剂量中药复方多糖组中AA基因型个体血清中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ的质量浓度较高，AD基因型个体血清中TNF-α的质量浓度较高；中剂量中药复方多糖组中AB基因型个体血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的质量浓度较高，AC基因型个体血清中IL-6的质量浓度较高，AA基因型个体血清中TNF-α的质量浓度较高；低剂量中药复方多糖组中AB基因型个体血清中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ的质量浓度较高，AC基因型个体血清中TNF-α的质量浓度较高。出现不同剂量中药复方多糖组中优势基因型不同的原因可能是：不同基因型鸡体内Th1型细胞因子和Th2 型细胞因子转录水平和表达水平的差异，使得产生细胞因子的量存在一定差异； TCR在识别被呈递的抗原的同时，也要识别细胞上的MHC II类分子，而MHC基因具有丰富的多态性，这会导致MHC II类分子抗原肽结合槽的结构不同，由此造成不同MHC等位基因编码的分子与抗原肽的结合具有一定的选择性，这种选择性反应不同个体对同一抗原会出现免疫应答的差异，进而导致不同剂量中药复方多糖组中MHCB-LβII的优势基因型不同；免疫系统对抗原的感知有数量和浓度上的敏感性差异，多糖的质量浓度过高或者过低均不会产生较高的免疫应答，从而引起细胞因子含量的差异；免疫性状除受MHCB-LβII基因调控外，还受到其他突变位点或者基因的调控，不同突变位点引起的免疫性状变化，对细胞因子的产生具有调节作用。

以上结果说明，MHCB-LβII基因多态性使鸡的免疫能力产生个体差异，并且对促进鸡免疫因子产生的最适多糖剂量会有一定影响。

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(责任编辑：顾玉兰 Responsible editor:GU Yulan)

Effects of Traditional Chinese Medicine Compound Polysaccharide on Serum Cytokines Mass Fraction in DifferentMHCB-LβIIGenotype Chickens

YANG Hongyang,ZHU Xiaoqing,SHANG Yunxia,GU Xinli and GUO Xiao

(College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi Xinjiang 832003,China)

In order to explore the effect ofMHCB-LβIIgene polymorphism on the immunomodulatory dose selection of traditional Chinese medicine compound polysaccharides(cCHMPS),PCR-SSCP technique was applied to group Huangma chickens according to differentMHCB-LβIIgenotypes,divided into high,medium and low dose Chinese medicine polysaccharide group and blank control group.Eight-day old chickens were vaccinated with 50 mg/mL,25 mg/mL,12.5 mg/mL cCHMP and physiologic saline, 0.2 mL for each one,once a day for seven successive days.On 21 days,42 days,56 days and 70 days,five chickens’ blood for each group were sampled for determination of serum IL-2,IL-4,IL-6,IFN-γ and TNF-α mass fraction.The results showed that cCHMPS at different dose could improve serum IL-2,IL-4,IL-6,IFN-γ and TNF-α mass fraction in eachMHCB-LβIIgenotypes.In high dose cCHMP,the serum IL-2,IL-4,IL-6 and IFN-γ mass fraction of AA genotype chicken were higher than those of the AB,BB,AC and AD genotype; in middle dose cCHMPS,the serum IL-2,IL-4 and IFN-γ mass fraction of AB genotype were higher than those of AA,BB,AC and AD genotype; in low dose cCHMPS,the serum IL-2,IL-4,IL-6 and IFN-γ mass fraction of AB genotype were higher than those of AA,BB,AC and AD genotype.The results demonstrated that the optimum immunodulatory dose of cCHMP were different in eachMHCB-LβIIgenotype chicken.

Traditional Chinese medicine compound polysaccharides;MHCB-LβIIgene; Cytokines; Chickens

YANG Hongyang,male,master student.Research area: clinical veterinary science.E-mail:hongyangy527@126.com

SHANG Yunxia,female,bachelor.Research area:animal disease prevention and control.E-mail:shangyunxia@shzu.edu.cn

日期：2017-03-30

2016-11-01

2016-12-12

国家自然科学基金(31460673)。

杨红洋，男，硕士研究生，研究方向为临床兽医学。 E-mail:hongyangy527@126.com

商云霞，女，学士，主要从事动物疫病防治研究。E-mail:shangyunxia@shzu.edu.cn 谷新利，男，教授，博士生导师，主要从事中药制剂开发与应用研究。E-mail:xlgu@shzu.edu.cn

S853.72

A

1004-1389(2017)04-0514-09

GU Xinli,male,professor,doctoral supervisor.Research area:development and application of traditional Chinese medicine preparation.E-mail:xlgu@shzu.edu.cn

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170330.1508.010.html

Received 2016-11-01 Returned 2016-12-12

Foundation item The National Natural Science Foundation of China (No.31460673).