产后患子宫内膜炎对奶牛血清和子宫黏液中免疫球蛋白质量浓度的影响

那立冬，张世栋，董书伟，闫宝琪，杨洪早，桑梦琪，贾 宁，王东升，严作廷

(1. 甘肃农业大学 动物医学院，兰州 730070；2. 中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050)

产后患子宫内膜炎对奶牛血清和子宫黏液中免疫球蛋白质量浓度的影响

那立冬1,2，张世栋2，董书伟2，闫宝琪2，杨洪早1,2，桑梦琪2，贾 宁1，王东升1,2，严作廷1,2

(1. 甘肃农业大学 动物医学院，兰州 730070；2. 中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050)

为比较分娩后患子宫内膜炎奶牛和健康奶牛血清及子宫黏液中IgA、IgM和IgG的变化，采用酶联免疫吸附测定法分别对奶牛血清和子宫黏液中IgA、IgM和IgG的质量浓度进行定量检测。结果表明，患病奶牛血清中的IgA和健康奶牛子宫黏液中的IgA持续降低，子宫黏液中IgA先降低后升高，健康奶牛血清中IgA变化不大；患病奶牛和健康奶牛子宫黏液和血清中IgG均先降低后升高；健康奶牛血清和子宫黏液中IgM先降低后升高，患病奶牛子宫黏液中IgM先升高后降低，后又升高，患病奶牛血清中IgM逐渐降低；患病奶牛血清中IgG始终高于健康奶牛的，说明IgG在全身体液免疫中发挥主要作用；患病奶牛子宫黏液的IgA和IgM高于健康奶牛，说明IgA和IgM在子宫局部免疫中发挥主要作用。

奶牛；子宫内膜炎；免疫球蛋白；质量浓度

子宫内膜炎是导致奶牛不孕的主要生殖疾病[1-2]，常引起奶牛子宫复旧延迟，卵泡发育和功能异常，繁殖力降低，屡配不孕，产奶量下降，致使治疗费用和淘汰率增加，经济效益降低，给奶牛养殖业造成严重的经济损失[3-5]。子宫内膜炎发生的主要原因是由于分娩时子宫颈开张和子宫内环境的急剧变化，细菌等主要的病原微生物趁机进入子宫，导致奶牛子宫细菌污染，尤其在产后1周内奶牛子宫的污染率达90%～100%，产后7 d左右子宫细菌达到动态平衡，即数量最多，产后10～14 d子宫内持续存在多种条件性致病菌，正常奶牛产后2～4周内大部分细菌被自发性排出，产后6周子宫污染物被彻底清除[6-8]。然而，至少20%的奶牛因为一些强致病性细菌的持续存在，或因子宫的免疫防御体系遭到破坏，机体未能将细菌排出，会导致子宫感染引起子宫内膜炎[9]。分娩后奶牛的免疫机能高低对子宫是否发生感染起着重要作用，特异性免疫球蛋白(immune globulin，Ig)在奶牛子宫复旧过程中发挥的作用极为关键[10]。Ig是体液免疫和局部黏膜免疫发挥重要作用的特异性免疫蛋白，普遍存在于动物血液、淋巴液、组织液和外分泌液中，在奶牛产后对抗子宫感染中起着重要作用[11]。因此，比较产后患子宫内膜炎奶牛和健康奶牛Ig质量浓度变化规律可以反映产后子宫的状态。近年来，国内外学者对分娩前后3周奶牛免疫状态的研究较多[12-14]，但对分娩3周后子宫复旧过程中奶牛免疫状态的研究较少。本试验以分娩后21～42 d奶牛为研究对象，检测血清和子宫黏液中IgA、IgG和IgM的质量浓度，结合奶牛子宫状态比较患子宫内膜炎奶牛和健康奶牛Ig质量浓度的变化趋势，为临床诊断、治疗和预防奶牛子宫内膜炎提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物及分组

试验选用的中国荷斯坦奶牛由甘肃省某奶牛养殖场提供。选择年龄在3～8岁、分娩时间相近、无其他疾病的产后奶牛，在产后21 d通过直肠检查和阴道分泌物性状鉴定，筛选出健康奶牛和临床型子宫内膜炎奶牛(患病牛)各9头，试验用奶牛采用牛场标准饲养管理程序进行饲喂。

1.2 样品采集和处理

于产后21、28、35和42 d采集每头奶牛的血液和子宫黏液。通过颈静脉采集血液约10 mL，分离血清，分装，低温保存带回实验室，-80 ℃保存，待用；通过子宫颈按摩方法将子宫黏液收集至试管，约50 mL。低温保存带回实验室，-80 ℃保存至少24 h，待黏液冻结后将冻结的黏液组织迅速取出约0.4 g，转移至组织研磨器中，按照1∶4(质量∶体积)的比例加入生理盐水，充分研磨后，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，分装，-80 ℃保存，待用。

1.3 主要试剂及器材

牛IgA ELISA定量检测试剂盒(货号140321)、牛IgG ELISA定量检测试剂盒(货号140711)和牛IgM ELISA定量检测试剂盒(货号140605)，Bethyl 公司产品；酶标板恒温振荡器(Abson；micbio-Ⅱ)；酶标仪(Thermo；MK3)；台式离心机(Scilogex；DMO412)等。

1.4 免疫球蛋白质量浓度测定

采用酶联免疫吸附双抗体夹心法定量检测奶牛血清和子宫黏液中IgA、IgM和IgG的质量浓度。试验操作严格按照试剂盒操作说明进行。

1.5 数据分析

数据以“平均值±标准差”表示，采用SPSS 19.0和GraphPad prism 5.0软件进行统计分析。组间数据比较采用t检验。

2 结果与分析

2.1 产后奶牛血清和子宫黏液中IgA的质量浓度变化

由图1和图2可知，健康奶牛血清中IgA质量浓度从产后21 d(0.183 g/L)开始下降，在28 d(0.116 g/L)后略有升高，42 d降至最低(0.107 g/L)。患病奶牛血清中IgA质量浓度在21 d最高(0.300 g/L)，35 d降至最低(0.124 g/L)(图1)；健康奶牛子宫黏液中IgA质量浓度在产后21 d 最高(0.419 g/L)，21～42 d逐渐降低，42 d最低(0.096 g/L)。患病奶牛子宫黏液中IgA质量浓度在21 d(0.692 g/L)开始降低，35 d最低(0.297 g/L)，而在42 d迅速升高(1.311 g/L)(图2)；患病奶牛血清在21 d极显著高于健康奶牛(P<0.01)，在28 d显著高于健康奶牛(P<0.05)。奶牛子宫黏液在21 d和28 d患病奶牛显著高于健康奶牛(P<0.05)，42 d患病奶牛极显著高于健康奶牛(P<0.01)；患病奶牛血清中IgA质量浓度持续降低，健康奶牛血清中IgA质量浓度变化不大。患病奶牛子宫黏液中IgA质量浓度先降低后升高，健康奶牛子宫黏液中IgA质量浓度持续降低。

产后时间相同的患病奶牛与健康奶牛相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。下图同。Compared endometritis cows having same postpartum days with healthy cows,* means significant difference atP<0.05，** means significant difference at theP<0.01.The same as below.

图1 奶牛血清中IgA质量浓度
Fig.1 Mass concentration of IgA in cows serum

图2 奶牛子宫黏液中IgA质量浓度Fig.2 Mass concentration of IgA in cows uterus mucus

2.2 产后奶牛血清和子宫黏液中IgG的质量浓度变化

由图3和图4可知，健康奶牛血清中IgG质量浓度在产后21 d最高(26.929 g/L)，35 d降至21.786 g/L，到42 d升高至25.280 g/L。患病奶牛血清中IgG质量浓度在21 d最高(37.990 g/L)，35 d降至最低(27.181 g/L)，42 d小幅度升高(27.731 g/L)(图3)；健康奶牛子宫黏液中IgG在产后21 d为9.793 g/L，28 d(6.919 g/L)小幅度降低，28～42 d先迅速升高后缓慢升至最高(34.309 g/L)。患病奶牛子宫黏液中IgG质量浓度在21～28 d缓慢升至19.249 g/L，在35 d降至最低(9.960 g/L)，42 d快速升至最高(31.074 g/L)(图4)；患病奶牛血清IgG质量浓度在21 d显著高于健康奶牛(P<0.05)，28 d极显著高于健康奶牛(P<0.01)。患病奶牛子宫黏液IgG质量浓度21 d显著高于健康奶牛(P<0.05)，28 d患病奶牛极显著高于健康奶牛(P<0.01)，在35 d健康奶牛极显著高于患病奶牛(P<0.01)。健康和患病奶牛血清中IgG质量浓度先降低后升高，且患病奶牛血清中IgG质量浓度始终高于健康奶牛。健康和患病奶牛子宫黏液中IgG质量浓度在21～42 d先降低后升高。

图3 奶牛血清中IgG质量浓度Fig.3 Mass concentration of IgG in cows serum

图4 奶牛子宫黏液中IgG质量浓度Fig.4 Mass concentration of IgG in cows uterus mucus

2.3 产后奶牛血清和子宫黏液中IgM的质量浓度变化

由图5和图6可知，健康奶牛血清中IgM质量浓度在产后21 d最高(3.543 g/L)，35 d降至最低(2.540 g/L)，42 d升高至2.817 g/L。患病奶牛血清中IgM质量浓度在21 d最高(3.374 g/L)，在42 d降至最低(2.591 g/L)(图5)；健康奶牛子宫黏液中IgM质量浓度在产后21 d为0.442 g/L，28 d降至最低(0.044 g/L)，在35 d升高至0.201 g/L，在42 d降低至0.043 g/L。患病奶牛子宫黏液中 IgM 质量浓度在21 d为1.164g/L，28d升至最高(1.650g/L)，35d降低至1.294 g/L，42 d质量浓度升高至1.363 g/L(图6)；21～42 d患病奶牛子宫黏液中IgM质量浓度极显著高于健康奶牛(P<0.01)；患病奶牛血清中IgM质量浓度逐渐降低，健康奶牛血清中IgM质量浓度先降低后升高。患病奶牛子宫黏液中IgM质量浓度先升高后降低，后又升高，健康奶牛子宫黏液中IgM质量浓度先降低后升高。

图5 奶牛血清中IgM质量浓度Fig.5 Mass concentration of IgM in cows serum

图6 奶牛子宫黏液中IgM质量浓度Fig.6 Mass concentration of IgM in cows uterus mucus

3 讨 论

产后奶牛子宫感染导致子宫内膜炎发生与机体免疫状态有着密切联系，Ig作为体液免疫的重要成分，在子宫局部黏膜中发挥重要作用，由病原微生物感染引起子宫炎症时，机体产生一系列的免疫答应，引起血液中Ig质量浓度迅速升高，部分Ig会被转移至子宫，同时子宫局部黏膜也会产生Ig，这些Ig一方面会直接作用于病原微生物，并在激活的补体系统的协助下使其溶解，同时也会通过对中性粒细胞调控使其发挥吞噬作用，所以Ig质量浓度变化可有效反映子宫的免疫状态[15-16]。本试验测定产后21～42 d健康奶牛与患子宫内膜炎奶牛血清和子宫黏液中IgA、IgG和IgM的质量浓度，并对健康奶牛和患子宫内膜炎奶牛的这些指标进行比较，分析产后患子宫内膜炎对奶牛血清和子宫黏液中Ig质量浓度的影响。

通过酶联免疫吸附试验方法检测Ig质量浓度，具有操作简单、灵敏度高的特点，且能定量反映Ig质量浓度变化。Ig变化的时间早于临床表现、病理变化，是判定子宫内膜炎发生的重要指标。可以运用此方法对奶牛子宫内膜炎症的变化进行动态监测，Ig变化幅度较大时，意味着可能发生子宫感染，应引起高度重视。但此检测方法应用也存在问题，血清中的Ig是全身性抗原感染的综合表现，不能定位局部。

有研究表明，产后健康奶牛血清中Ig以IgG和IgM为主，IgA质量浓度很低[17-19]，与本研究结果一致。奶牛子宫黏液中Ig以IgG和IgA为主，IgM质量浓度则很低[20]。但本研究对患病奶牛Ig质量浓度检测发现，患病奶牛子宫黏液中IgM的质量浓度高于IgA，且极显著高于健康奶牛，可能是由于子宫复旧过程健康奶牛子宫中主要以IgG和IgA免疫为主，但发生子宫感染则会诱导IgM大量产生并参与抗感染作用。本研究还发现，患病奶牛血清中IgM质量浓度与健康奶牛并无差异，可能原因是子宫感染后血液中增加的IgM转移至子宫，引起子宫黏液IgM的升高，增强子宫的抗感染作用。

产后奶牛子宫遭受到病原微生物污染时，大部分奶牛在分娩后2～4周通过自身的免疫调节和子宫复旧能清除病原微生物，从而恢复子宫的正常功能[8,18]。本研究发现，患病奶牛血清和子宫黏液中IgA和IgG质量浓度在21～28 d均高于健康奶牛，并在28～35 d逐渐降低，在35 d除子宫黏液中IgG远低于健康奶牛外，其他均与健康奶牛无显著差异。患子宫内膜炎奶牛Ig质量浓度普遍高于健康奶牛这种变化规律与其他学者报道一致[6,12]。但在35 d健康子宫黏液中IgG的质量浓度突然升至相对较高水平，在42 d患病奶牛子宫黏液中IgA和IgG的质量浓度也突然的升至较高水平，这种急速的变化可能与产后子宫复旧程度有关。

试验结果表明，患病奶牛血清中IgG质量浓度始终高于健康奶牛，说明IgG在全身体液免疫中发挥主要作用；患病奶牛子宫黏液中IgA和IgM高于健康奶牛，说明IgA和IgM在子宫局部免疫中发挥主要作用。

Reference：

[1] 贾智丽,李培锋.包头地区治疗奶牛子宫内膜炎临床用药情况调查[J].中国畜牧兽医,2016,43(1):261-266.

JIA ZH L,LI P F.Investigation of clinical medicine for treating cows endometritis in Baotou area[J].ChinaAnimalHusbandry&VterinaryMedicine,2016,43(1):261-266(in Chinese with English abstract).

[2] 闫宝琪,董书伟,王东升,等.奶牛隐性子宫内膜炎诊断技术研究进展[J].中国畜牧兽医,2016,43(3):683-688.

YAN B Q,DONG SH W,WANG D SH,etal.Research progress on diagnosis methods of subclinical endometritis in dairy cows[J].ChinaAnimalHusbandry&VterinaryMedicine,2016,43(3):683-688(in Chinese with English abstract).

[3] BELL M J,ROBERTS D J.The impact of uterine infection on a dairy cow’s performance[J].Theriogenology,2007,68(7):1074-1079.

[4] POTTER T J,GUITIAN J,FISHWICK J,etal.Risk factors for clinical endometritis in postpartum dairy cattle[J].Theriogenology,2010,74(1):127-134.

[5] HERATH S,LILLY S T,FISCHER D P,etal.Bacterial lipopolysaccharide induces an endocrine switch from prostaglandin F2alpha to prostaglandin E2 in bovine endometrium[J].Endocrinology,2009,150(4):1912-1920.

[6] 李德军,刘运枫,周晓玲,等.患子宫内膜炎奶牛免疫应答变化规律的研究[J].东北农业大学学报,2011,42(6):86-90.

LI D J,LIU Y F,ZHOU X L,etal.Analysis of immune response of cows with endometritis[J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity,2011,42(6):86-90(in Chinese with English abstract).

[7] BONDURANT R H.Inflammation in the bovine female reproductive tract[J].JournalofAnimalScience,1999,77 (S2):101-110.

[8] SHAN H,LILLY S T,SANTOD N R,etal.Expression of genes associated with immunity in the endometrium of cattle with disparate postpartum uterine disease and fertility[J].ReproductiveBiology&Endocrinology,2009,7(1):1-13.

[9] AZAWI O I.Postpartum uterine infection in cattle[J].AnimalReproductionScience,2008,105(3/4):187-208.

[10] BRODZKI P,KOSTRO K,BRODZKI A,etal.Determination of selected parameters for non-specific and specific immunity in cows with subclinical endometritis[J].AnimalReproductionScience,2014,148(3/4):109-114.

[11] VIDUZA M,LIEPA L.The importance of application of immunoglobulin semi-quantitative tests to control the cow herd health[J].VeterinarmedicinasRaksti,2010:154-159.

[12] 李刚诗,王晓艳,袁 听,等.围产期健康奶牛血清和初乳中免疫球蛋白含量的变化[J].中国兽医学报,2015,35(2):273-277.

LI G SH,WANG X Y,YUAN T,etal.Changes of immunoglobulin protein content in serum and colostrum during healthy periparturient dairy cows[J].ChineseJournalofVeterinaryScience,2015,35(2):273-277(in Chinese with English abstract).

[13] HERR M,BOSTEDT H,FAILING K.IgG and IgM levels in dairy cows during the periparturient period[J].Theriogenology,2011,75(2):377-385.

[14] 孙跃博,罗瑞卿,陈 洁,等.中药对围产期奶牛血液免疫及抗氧化活性指标的影响[J].西北农业学报,2015,24(11):18-23.

SUN Y B,LUO R Q,CHEN J,etal.Effects of traditional chinese medicine on the hematogenic immunity and antioxidant activity of perinatal cows[J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2015,24(11):18-23(in Chinese with English abstract).

[15] 胡广胜,王旭荣,杨 峰,等.奶牛子宫内膜炎免疫调控研究进展[J].动物医学进展,2013,34(11):92-96.

HU G SH,WANG X R,YANG F,etal.Progress on immune regulation of cow endometritis[J].ProgressinVeterinaryMedicine,2013,34(11):92-96(in Chinese with English abstract).

[16] DHALIWAL G S,MURRAY R D,WOLDEHIWET Z.Some aspects of immunology of the bovine uterus related to treatments for endometritis[J].AnimalReproductionScience,2001,67(3/4):135-152.

[17] 李德军.奶牛隐性和临床型子宫内膜炎病理机制研究[D].武汉:华中农业大学,2010.

LI D J.Study on pathogenesis of subclinical and clinical endometritis[D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2010(in Chinese with English abstract).

[18] SINGH J,MURRAY R D,MSHELIA G,etal.The immune status of the bovine uterus during the peripartum period[J].TheVeterinaryJournal,2008,175(3):301-309.

[19] KRAUSE A R T,PFEIFER L F M,MONTAGNER P,etal.Associations between resumption of postpartum ovarian activity,uterine health and concentrations of metabolites and acute phase proteins during the transition period in Holstein cows[J].AnimalReproductionScience,2014,145(1/2):8-14.

[20] VINCENTI L,TONI F,NEBBIA P,etal.Post partum endometritis in the cow[J].AttiDellaSocietàItalianaDelleScienzeVeterinarie,2004,28(6):34-40.

(责任编辑：顾玉兰 Responsible editor:GU Yulan)

Effects of Dairy Cows with Endometritis on Immunoglobulin Mass Concentration in Serum and Uterus Mucus of Postpartum

NA Lidong1,2,ZHANG Shidong2,DONG Shuwei2,YAN Baoqi2,YANG Hongzao1,2,SANG Mengqi2,JIA Ning1,WANG Dongsheng1,2and YAN Zuoting1,2

(1. College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China； 2.Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Pharmaceutical Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730050,China )

In order to compare healthy cows with the mass concentration variation of IgA,IgM and IgG in serum and uterus mucus in postpartum dairy cows sufering from endometritis.The mass concentration of IgA,IgM and IgG in uterus mucus and serum were detected by the method of enzyme-linked immunosorbent assay. The results showed that the mass concentration of IgA reduced continuously both serum of endometritis cows and uterus mucus of healthy cows. The IgA mass concentration in uterus mucus decreased initially and then increased in cows suffering from endometritis,There was no great change in the mass concentration of IgA in the serum of healthy cows ; IgG levels of the uterus mucus and serum in endometritis cows and healthy cows decreased firstly and then increased; IgM mass concentration in serum and uterus mucus of healthy cows decreased firstly and then increased,IgM mass concentration in uterus mucus of cows with endometritis increased firstly and then decreased,the IgM levels in serum of endometritis cows gradually reduced. These indicated that IgG in serum of cows suffering from endometritis was always higher than that of healthy cows,so it is appoved that IgG played a major role in systemic humoral immunity. The mass concentration of IgA and IgM in uterus mucus of postpartum dairy cows with endometritis was higher than that of healthy cows,this results indicated that IgA and IgM played the key role in local immunity of the uterus.

Dairy cows；Endometritis；Immuneglobulin；Mass concentration

NA Lidong,male,master student.Research area:diagnosis and prevention of cow disease. E-mail:17709317797@189.cn

YAN Zuoting,male,research fellow.Research area:R&D of new traditional Chinese veterinary medicine,diagnosis and prevention of cow disease. E-mail:yanzuoting@caas.cn

日期：2017-03-30

2016-07-19

2016-09-30

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1610322015003)；“十二五”国家科技支撑计划(2012BAD12B03)；中国农业科学院农业科技创新工程(CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-03)。

那立冬，男，硕士研究生，研究方向为奶牛疾病诊断与防治。E-mail:17709317797@189.cn

严作廷，男，研究员，研究方向为中兽药研发、奶牛疾病诊断与防治。E-mail:yanzuoting@caas.cn 王东升，男，副研究员，研究方向为中药药理与奶牛繁殖疾病。E-mail:lzmyswds@126.com

S857.23；S858.23

A

1004-1389(2017)04-0503-06

WANG Dongsheng,male,associate research fellow.Research area:pharmacology of Chinese medicine and dairy cow reproduction disease. E-mail:lzmyswds@126.com

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170330.1508.006.html

Received 2016-07-19 Returned 2016-09-30

Foundation item Basal Scientific Research Funds for Central Public-Interest Scientific Institutions(No.1610322015003); National Science and Technology Support Program in “12th Five-year” Plan(No.2012BAD12B03);Agricultural Science and Technology Innovation Program (No.CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-03).