伊犁马DMRT3基因多态性研究

何美升，于茜，高程程，曹行，马海玉，刘玲玲，姜鑫，刘武军

(新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052)

伊犁马DMRT3基因多态性研究

何美升，于茜，高程程，曹行，马海玉，刘玲玲，姜鑫，刘武军

(新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052)

【目的】以103匹伊犁马(速步型)为研究对象，研究伊犁马DMRT3基因多态性与步法性状之间的相关性。【方法】运用PCR-RFLP方法对伊犁马DMRT3基因进行多态性分析。【结果】该基因在伊犁马上存在3种基因型，分别为CC、CA和AA，测序结果显示：DMRT3的碱基突变位置为g.22999655C>A，该突变导致氨基酸编码提前终止，经关联分析，该突变对伊犁马速度有显著影响(P<0.05)。【结论】伊犁马DMRT3基因突变与速度之间存在关联性，且可能是伊犁马步法性状的重要位点。

伊犁马；DMRT3基因；步法性状；速步性能

0 引 言

【研究意义】马匹的运动能力直接决定着马匹的竞技水平和经济价值，近些年来，优质运动马的选育成为研究热点。新疆的马品种丰富，其中伊犁马闻名中外，伊犁马主要分布于伊犁河谷地区，是知名的优良马种，不仅是肉乳兼用，更具有良好的运动性能。【前人研究进展】在速步赛事中，不同的步法性状对运动能力和比赛成绩有着至关重要的影响[1]。DMRT基因在控制性别发展、调节性别分化和雄性不育方面有重要作用[2,3,4]。L S. Anderson等[5]发现DMRT3基因是控制冰岛马的步法的主效基因，DMRT3基因突变增强了马匹肢体同侧的运动能力[6]。K. Jaderkvist等[7,8]研究表明DMRT3基因突变与标准种、法国速步以及北欧速步马的速步性能有很大的关系，也对冰岛马的骑乘性能产生一定的影响。随后，K. Jaderkvist等[9]又对180匹芬兰马(速步型)，59匹(骑乘型)进行了DMRT3基因的分型。不同的基因型对芬兰马的竞技能力和经济价值有重要的影响。【本研究切入点】DMRT3基因突变是马匹的运动模式改变的遗传因素之一，不同基因型对速步型马匹的步法类型、运步能力等有着重要影响。目前有关伊犁马DMRT3基因多态性的研究还未见报道。研究以伊犁马(速步型)为研究对象，研究伊犁马DMRT3基因多态性与步法性状之间的关系。【拟解决的关键问题】运用PCR-RFLP方法，检测分析DMRT3基因的多态性，对该基因的多态性与伊犁马步法性状进行相关分析，为选育优良运动性能的伊犁马提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

在伊犁哈萨克自治州昭苏军马场，选取103匹伊犁马，颈静脉采血5 mL，枸橼酸钠抗凝，-20℃保存。

1.2 方 法

1.2.1 血液基因组DNA的提取与检测

试验操作参照《分子克隆指南》[10](第3版)，用酚-氯仿抽提法提取DNA。

1.2.2 引物设计

试验参照Han等[11]设计的DMRT3基因引物序列，列出引物信息。表1

表1 引物信息

Table 1 Primer information

基因Gene引物序列(5’→3’)Primersequence长度(bp)Size退火温度(℃)AnnealingtemperatureDMRT3F：CGACAAAGACACCGACCAGAR：CCGATCCCACGGACCATT485551

1.2.3 PCR扩增

反应体系20 μL：DNA模板1.0 μL，PCR Mixture 10 μL，F引物0.5 μL、R引物0.5 μL，加ddH2O至20 μL。反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 min，退火30 s，72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.4 PCR-RFLP分析

酶切反应体系为10 μL：PCR产物5 μL，10×PCR Buffer 1 μL，限制性内切酶DdeI 0.3 μL，ddH2O 3.7 μL。恒温箱37℃酶切过夜。

1.3 数据统计

利用Excel整理表型数据；利用生物信息软件计算基因频率、基因型频率、基因纯合度(homozygosity,Ho)、基因杂合度(heterozygosity,He)、有效等位基因数(effective number of alleles,Ne)和多态信息含量(polymorphism information content,PIC)。利用SPSS18.0软件进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

伊犁马基因组DNA提取后，DNA检测条带清晰明亮，可用于后续试验。图1

图1 基因组DNA检测

Fig.1 Electrophoresis detection of genomic DNA

2.2DMRT3基因的PCR扩增产物检测

将DMRT3基因进行PCR扩增后，产物检测表的PCR产物检测条带清晰明亮，产物大小与预期一致，可用于后续试验。图2

1～7,DMRT3PCR扩增产物;M,DL600DNA Maker

1-7,PCR products ofDMRT3;M,DL600DNA Maker

图2DMRT3的PCR检测结果

Fig.2 PCR detection result ofDMRT3

2.3DMRT3基因的多态性检测

2.3.1 DMRT3基因的PCR-RFLP检测结果

用限制性内切酶DdeI将PCR产物酶切后，显示DMRT3基因具有多态性，有3种基因型：CC、CA和AA。图3

图3DMRT3基因PCR-RFLP检测结果

Fig.3 PCR-RFLP detection result ofDMRT3 gene

2.3.2DMRT3基因的测序结果

将PCR扩增产物进行测序。研究表明，DMRT3基因的碱基突变位置为g.22999655C>A，该突变为无义突变，导致了氨基酸编码提前终止。图4

图4DMRT3基因测序结果

Fig.4 Sequencing result ofDMRT3 gene

2.4 伊犁马DMRT3基因的群体遗传结构

研究表明，伊犁马群体中，DMRT3优势基因型为CA基因型，快步型中，优势等位基因为C；在对侧步型中，优势等位基因为A。表2

表2DMRT3基因的基因型分布

Table 2 Genotye distribution ofDMRT3 gene

步法类型Gaittype样本(匹)Sample基因型频率Genotypefrequency等位基因频率AllelefrequencyCCCAAACA快步970289(28)0649(63)0061(6)06130387对侧步600833(5)0167(1)04170583

2.5 纯合度(Ho)、杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)

研究表明，伊犁马群体快步型和对侧步型的Ho、He、Ne分别为0.351、0.649、1.902和0.514、0.486、1.946；PIC分别是 0.362和0.368，为中度多态位点。表3

表3 伊犁马DMRT3基因的Ho,He,Ne和PIC

Table 3Ho,He,Neand PIC ofDMRT3 gene loci of Yili Horses

步法类型Gaittype样本Sample基因纯合度Ho基因杂合度He有效等位基因数Ne多态信息含量PIC快步970351064919020362对侧步60514048619460368

2.6 伊犁马2种步法速度的差异

研究表明，在伊犁马群体中，1 000 m速步赛事2种步法速度比较发现，对侧步型个体速度显著快于快步型(P<0.05)。表4

表4 伊犁马2种步法类型速度差异

Table 4 The difference between 2 gait types and speed of Yili Horses

步态速度(m/s)对侧步778±059a快步706±070b

注：同列，肩标字母不同时，差异显著(P<0.05)

Note: In the same row, values with different letter superscripts mean significant difference(P<0.05)

2.7DMRT3基因不同基因型与速度的关联分析

研究表明，伊犁马1 000 m速步赛中，CA和AA基因型个体的速度显著高于CC基因型个体(P<0.05)，CA与AA基因型之间差异不显著(P>0.05)。表5

表5 DMRT3基因不同基因型与速度的关系

Table 5 The relationship betweenDMRT3 genotypes and speed

DMRT3基因DMRT3gene基因型GenotyesCCCAAA速度(m/s)687±044b759±081a764±041a

注：同行，肩标字母不同时，差异显著(P<0.05);肩标字母相同时，差异不显著(P>0.05)

Note: In the same row,values with different letter superscripts mean significant difference(P<0.05);While with the same superscripts mean no significant difference(P>0.05)

3 讨 论

DMRT3基因主要与动物生长、性别控制有关[12,13]；同时该基因与马匹运动能力有关。近年来，国外学者着力于DMRT3基因突变对于步法和竞技能力影响的研究，结果表明，DMRT3基因单碱基突变是马匹运动模式改变的主要因素，该突变对马的速步性能有很重要的影响[14]。

3.1 步法和速度的关系

对侧步的主要特点是同侧肢体同时运动，而快步是对角线前后肢体同时运动，这是两种步法最本质的区别。在短距离赛马比赛的速步赛中，对侧步比快步更有优势，具有对侧步法的马运动时，上下波动小，步频快，速度轻快。试验发现在伊犁马群体中，快步型居多，对侧步型少；对两种步型在测试赛中的数据结果比较显示，对侧步型的平均速度比快步型快(P<0.05)。说明在伊犁马群体的短途速步比赛中，对侧步个体更有优势。

3.2 不同基因型与步法的关系

DMRT3基因AA纯合突变对马匹的步法产生了影响，增强了马匹同侧前后肢的运动能力，即增强了对侧步能力和其他衍生步法能力，同时还增强运动时平衡感和肢体的协调能力[15]。试验利用PCR-RFLP方法对伊犁马DMRT3基因多态性检测发现存在g.22999655C>A的突变，在快步群体中，有3种基因型：CC、CA和AA， AA纯合突变并未导致步法类型的变化，有可能是AA型个体长期处于快步群体中，需要特定的调教才能训练出对侧步；也有可能是伊犁马所处的地域环境和气候、饲养管理水平及用于农用运输从而导致某些性状的变异与传统的核内遗传学原理不符，可能与DNA的甲基化和其他表观遗传学有关。对侧步型群体中，只有2种基因型，CA和AA，表明A等位基因可能更利于速步竞技。

3.3 不同基因型和速度的关系

前人研究表明，A等位基因会影响速度型赛马的比赛成绩，可能会减慢比赛速度。Guilherme L. Pereira等[16]在对296匹夸特马的g.22999655C>A的研究发现，等位基因A频率极低，并且对夸特马的速度有影响，不利于速度竞技。在试验中，速步型群体中CA型频率最高，CC型次之，AA型最少，其中，CA型和AA型群体平均速度比CC型快，差异达到显著水平(P<0.05)，这与Guilherme L. Pereira等[16]的研究结果不同，可能与速度型赛马和速步型赛马群体之间存在群体间的遗传差异有关，也可能是伊犁马长期处于农用，短途速力不突出，导致某些性状在群体间差异不大。

4 结 论

在伊犁马速步型群体中，伊犁马对侧步型平均速度大于快步型(P<0.05)；伊犁马DMRT3基因存在3种基因型，CC、CA和AA， AA纯合突变没有改变伊犁马的步法类型，但是，在速步赛测试中CA和AA型速度比CC型快(P<0.05)，A等位基因可能有利于伊犁马速步赛的竞技能力，对伊犁马的步法性状具有重要影响。

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Fund project:National science and technology support project (2012BAD44B01)

Polymorphism Analysis ofDMRT3 Gene in Yili Horse

HE Mei-sheng, YU Xi, GAO Cheng-cheng , CAO Hang, MA Hai-yu, LIU Ling-ling, JIANG Xin, LIU Wu-jun

(CollegeofAnimalScience,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

【Objective】 In this study, the project aims to analyze the association ofDMRT3 gene polymorphism with gait trait in trotting type of 103 individuals Yili horse.【Method】Genetic polymorphism ofDMRT3 gene was detected by PCR-RFLP and DNA sequencing technology.【Result】The result showed that there was 1 mutation inDMRT3 gene and there were 3 genotypes: CC, CA and AA. The SNPg.22999655 C>A was identified inDMRT3 gene by sequencing, and it caused the premature stop of the encoded acid. Statistical results indicated that the SNP was significantly associated with speed in Yili horse (P<0.05).【Conclusion】The mutation might be acted as an crucial DNA genetic marker for trotting performance traits selection in Yili horse.

Yili horse;DMRT3 gene; gait trait; trotting performance

2016-04-23

国家科技支撑计划项目课题(2012BAD44B01)

何美升(1990-)，男，四川人，硕士研究生，研究方向为动物遗传育种与繁殖，(E-mail)317924834@qq.com

刘武军(1966-)，女，新疆人，教授，博士生导师，研究方向为动物遗传育种与繁殖，(E-mail)lwj_ws@163.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.01.024

S821.2

A

1001-4330(2017)01-0184-06