石榴花色苷相关基因(PgANS、PgCHS、PgACT)的克隆与序列分析

吴忠红，杜鹃，阿塔吾拉·铁木尔，周江，许静，吴斌

(1.新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，乌鲁木齐 830091； 2.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉 831100；3．新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052)

石榴花色苷相关基因(PgANS、PgCHS、PgACT)的克隆与序列分析

吴忠红1，杜鹃2，阿塔吾拉·铁木尔1，周江3，许静3，吴斌1

(1.新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，乌鲁木齐 830091； 2.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉 831100；3．新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052)

【目的】获得石榴果实PgANS、PgCHS和PgACT基因，并对这三个基因进行序列分析。【方法】以喀什甜石榴为试材，通过酚-氯仿法提取籽粒中的总RNA，用TIANScript cDNA试剂盒反转录合成第一链cDNA，并用特异引物对其RT-PCR扩增，将得到的cDNA片段连接到PMD19-T载体上，然后将该载体转到DH5α，并对阳性克隆进行序列分析。【结果】PgANS基因片段长度为474 bp，Genbank登录号为KT779433，与NCBI数据库中KF841619、GU376749两种石榴核苷酸的同源性均为99%，与甘薯核苷酸(GU59821)、白桑核苷酸(JF499385)、草莓核苷酸(AY695817)的同源性分别为85%、79%、76%；PgCHS和PgACT基因片段长度分别为140 bp和148 bp，分别与NCBI数据库中JF747148、GU376750两种石榴核苷酸同源性为99%和93%。【结论】获得PgANS、PgCHS和PgACT基因片段，为进一步研究贮藏条件对石榴籽粒花色苷的影响奠定了基础。

花色苷；PgANS；PgCHS；PgACT；克隆

0 引 言

【研究意义】花色苷是花青素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，具有类黄酮的典型结构，它是植物器官中的主要呈色物质，水果、蔬菜、花卉、彩色叶片等丰富多彩的颜色大部分与其有关，对植物适应和抵御不良环境具有重要意义[1-2]。迄今为止己发现的花青素有20多种，石榴中主要有6种，分别是天竺葵色素(pelargonidin)、矢车菊色素(cyaniding)、花翠素(delphinidin)、芍药色素(peonidin)、牵牛色素(petunidin)和锦葵色素(malvidin)等[3]。国内外学者研究发现石榴中花色苷具有消炎、抗癌、预防肥胖等生理功能[4-5]，石榴以鲜食为主，但石榴在贮藏过程中花色苷受光照、氧气等因素影响较大，使其抗氧化性能下降[6]。现代贮藏技术能使石榴保存3～4个月，虽延缓了表皮褐变，但内部籽粒的品质劣变，褐化或透明化等现象十分普遍，已经成为限制石榴供应春节市场的瓶颈[7]。研究石榴籽粒劣变原因和机理对于改善贮藏条件，延缓石榴籽粒的劣变，提高石榴的商品性和食用性具有重要的现实意义。【前人研究进展】目前，采后石榴贮藏保鲜研究主要集中在贮藏过程的生理品质、冷害和病害[8-9]分析方面，针对石榴果实籽粒颜色变化的研究报道较少,张丽婷[7]从生理生化角度分析了同品种，不同温度和不同包装方式对石榴籽粒色泽劣变的影响因子，王敏[10]，申林等[11]研究贮藏温度对鲜食石榴籽粒贮藏品质、活性成分及抗氧化能力的影响，而石榴分子生物学研究主要集中在种质资源的分子标记[12]和观赏园艺角度的花瓣中花色苷合成相关的DFR,F3’H基因的分离克隆和序列分析，招雪晴、陶吉寒等[13-15]从粉花、红花石榴中分离克隆到DFR和F3’H基因。【本研究切入点】从分子层面研究采后石榴品质变化，尤其是与籽粒颜色劣变有关的报道较少。研究从食用性和商品性角度分析籽粒劣变的分子机理,分离鉴定花色苷合成相关基因，为进一步研究其功能和调控机理奠定基础。【拟解决的关键问题】以喀什甜石榴为研究材料，根据Genbank数据库选择与石榴亲缘关系最近的同属石榴花色苷基因KF841619、GU376749和JF747148的mRNA序列，设计扩增喀什石榴ANS、CHS和Actin基因保守区的引物。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 石榴

石榴果实采自新疆喀什疏附县。

1.1.2 主要试剂

酚-氯仿总RNA提取等试剂均为国产分析纯；Promega PCR MIX，TIANGEN反转录试剂盒、TIANGEN DNA Marker 2000、琼脂糖凝胶回收试剂盒、TIANGEN感受态细胞DH5α、pMD19-T载体等分子试剂购自新疆宝信生物工程有限公司。

1.1.3 引物设计

根据Genbank数据库报道的与石榴亲缘关系最近的同属石榴花色苷基因KF841619、GU376749和JF747148的mRNA序列设计扩增喀什石榴PgANS、PgCHS和PgACT基因保守区的引物，PgANS上游引物：TACGGGCATTGGCGACGAG，PgANS下游引物：AGGTGCGGGAAGGGAACTGG；PgCHS上游引物：GAGTGCTCGTAGTCAGCG，PgCHS下游引物：GCAATTTGGAATATGGGTC；PgACT上游引物：CTGGTGATGGTGTGAGTCA，PgACT下游引物：ATTTCCCGTTCAGCAGTAGTT，引物由上海生工合成。

1.2 方 法

1.2.1 RT-PCR扩增

参照反转录试剂盒说明书将提取的总RNA合成cDNA第一链。PCR扩增体系为：10×buffer缓冲液2.5 μL, dNTP(2.5 mM)2 μL，上、下游引物(10 pmol)各1 μL，cDNA 2 μL，DNATaq，0.3 μL，ddH2O 16.2 μL，总体积为25 μL。反应参数为94℃预变性3 min后，94℃变性1 min，52～57℃退火45s，72℃延伸1 min，进行35个循环，72℃延伸10 min。PCR扩增结束后，取产物7 μL经琼脂糖凝胶电泳鉴定。对预期目的条带进行胶回收，按TIANGEN生化凝胶回收试剂盒说明书进行。

1.2.2 PCR产物的克隆及序列测定

PCR的回收产物与pMD19-T载体相连，按连接反应试剂盒说明书操作。连接产物转化感受态细胞DH5α，氨苄抗性、蓝白斑筛选阳性克隆子，并对阳性克隆子进行37℃,180 mg/mL液体培养基培养过夜,经菌液PCR验证后，取1ml菌液(或将100 μL PCR产物)送上海生工测序。

1.2.3 序列比对分析

利用BLAST比对序列查看同源性，选取亲缘关系较近的核苷酸序列用DNAMAN软件进行多重比对，构建系统发育树，完成序列鉴定。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取

研究表明，18s和28s，且28s的RNA是18s的RNA亮度的两倍，并且没有明显拖尾现象，说明采用快速提取法提取的RNA纯度较高、质量较好，无明显降解，可用于基因克隆实验。图1

图1 石榴籽粒RNA提取

Fig.1 Extraction RNA from pomegranate kernels

2.2PgANS基因、PgCHS和PgACT基因cDNA片段的扩增

研究表明，石榴籽粒中PgANS基因cDNA片段500 bp左右处有条带，PgCHS基因cDNA片段150 bp左右处有条带,PgACT基因cDNA片段160 bp左右处有条带。从图中看出，每条基因条带特异性较好，清晰度较高，与预计大小相符，故初步表明已经扩增得到目的基因片段。因此，PgCHS和PgACT基因的PCR产物送上海生工测序；将PgANS的PCR产物回收纯化，进行后续实验。图2

注：M:DNA Marker2000,1：PgANS(a)、PgCHS(b)和PgACTIN(c)的RT-PCR产物

Note: M:DNA Marker2000,1：RT-PCR products ofPgANS(a)、PgCHS(b)andPgACT(c)

图2PgANS基因(a)、PgCHS基因(b)和PgACTIN(c)的RT-PCR扩增凝胶电泳分析

Fig.2 The electrophoresis analysis of RT-PCR products ofPgANS(a)、PgCHS(b)andPgACT(c)

2.3 克隆测序及同源性分析

将PgANS的PCR回收产物与克隆载体连接、转化后，在含有X-Gal和IPTG的LB平板培养基上进行蓝白斑筛选，并分别挑选若干个白斑转化子接种到LB培养基中进行摇培。将培养好的菌液采用通用引物进行RT-PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，可见挑取的白斑为插入片段的阳性克隆，若插入片段与扩增得到的片段大小基本一致，说明它们对应的质粒都是含有目的片段的重组质粒。每个基因挑选3个样品，送上海生物工程有限公司测序。图3

采用Nucleotide blast程序，将PgANS、PgCHS和PgACT基因的测序结果提交至NCBI的GenBank数据库中进行同源性搜索，并与其它物种比较并分别构建基因的系统发育树发现，分离克隆的石榴PgANS片段为474bp(图4，图7)，与已发表的GenBank登录号为KF841619、GU376749的同源性为99%，与甘薯核苷酸(GU598212)的同源性为85%，与白桑核苷酸(JF499385)的同源性为79%，与草莓核苷酸(AY695818)的同源性为76%；PgCHS基因片段长度为140bp，与已发表的GenBank登录号为JF747148的石榴核苷酸同源性为99%(图5，图7)；PgACT基因片段长度为148 bp，与已发表的GenBank登录号为JF747148的石榴核苷酸同源性为93%(图6，图7)。由此可知，分离到的基因片段是目的基因。另外，将PgANS片段序列提交至GenBank，获得登录号为KT779433。图4～7

M:DNA Marker2000,1.2.3：重组质粒pGM-T-PgANS的PCR产物

M:DNA Marker2000, 1.2.3：PCR products from pGM-T-PgANS

图3 重组质粒pGM-T-PgANS的PCR鉴定

Fig.3 The PCR identification of recombinant plasmid pGM-T-PgANS

图4 喀什石榴和其他物种ANS核苷酸保守域序列比对

Fig.4 Comparison of the deduced nucleotide sequence nucleotide sequence ofANSgene conservative region from kashgar pomegranate and other species

图5 喀什石榴和其他物种CHS核苷酸保守域序列比对

Fig.5 Comparison of the deduced nucleotide sequence nucleotide sequence ofCHSgene conservative region from kashgar pomegranate and other species

图6 喀什石榴和其他物种Actin核苷酸保守域序列比对

Fig.6 Comparison of the deduced nucleotide sequence nucleotide sequence ofActingene conservative region from kashgar pomegranate and other species

图7 喀什石榴与其他植物的ANS、CHS和Actin的系统进化分析

Fig.7 Phylogenetic analysis ofANS,CHSandActingenes from kashgar pomegranate and other species

3 讨 论

花色苷是类黄酮的一种,受多种合成酶的影响，主要有苯丙氨酸解氨酶(DAL)、査尔酮合成酶(CHS)、査尔酮异构酶(CHI)、黄烧酮经化酶(F3’H)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)、花色素合成酶(ANS)、类黄酮糖苦转移酶(UFGT),同时类黄酮合成过程还受到相关调控基因的影响，调节基因通过调控合成途径中的相关酶基因的表达来影响花色苷的合成[16]。目前，ESPLEY[17]分离得到MdMYB10转录因子并转化烟草，结果显示能促进烟草花色积累。Ramsay[18]发现bHLH蛋白对拟南芥有多重作用，既可以调控花青的合成，也调控表皮毛和根毛的形成，同时在种皮中能控制原花青苷(PA)的合成,Ben Simhon[19]得出石榴中的WD40蛋内为PgTTG1蛋白,它调控果实发育中的花靑哲积累，同时还可以与PgAn1、PgAn2共同影响着花靑苷合成的下游结构基因的表达。

石榴是集食用、药用和观赏于一体的水果[20-21]，石榴以鲜食为主，但由于石榴采后萼筒对呼吸强度和蒸腾作用影响较大，石榴果实采后极易出现果皮褐变，失水皱缩，籽粒花青素降解，异味和腐烂[22]。在研究石榴保鲜过程中发现保鲜效果与粒色存在一定的相关性,因此，研究从探讨石榴贮藏期间籽粒色泽劣变的生理机制入手，为石榴的安全贮藏及籽粒色泽劣变的预防提供理论依据。将有助于阐明籽粒色泽变化过程中花色苷合成途径的生理生化代谢机理，为选择适宜的石榴保鲜技术改善籽粒颜色提供理论基础。花色苷合成受多种酶和基因调控的影响，通常受保鲜处理方法的影响而发生不同表达，而研究只对PgANS、PgCHS和PgACT基因进行了分离克隆，因此相关基因的表达分析和其他花色苷基因的分离克隆是今后的研究重点。

4 结 论

研究采用同源克隆方法克隆了石榴籽粒中花色苷基因PgANS、PgCHS和PgACT，得到了cDNA片段，其中PgANS基因片段长度为474 bp，申请Genbank登录号为KT779433，与NCBI数据库中登录号为KF841619、GU376749两种石榴核苷酸的同源性均为99%，与甘薯核苷酸(GU59821)、白桑核苷酸(JF499385)、草莓核苷酸(AY695817)的同源性分别为85%、79%、76%；PgCHS和PgACT基因片段长度分别为140和148 bp，分别与NCBI数据库中登录号为JF747148、GU376750的两种石榴核苷酸同源性为99%和93%，为进一步研究花色苷全长序列和基因的生物信息学功能等工作奠定了理论基础，花色苷合成受多种酶和基因调控的影响，通常受保鲜处理方法的影响而发生不同表达，而研究只对PgANS、PgCHS和PgACT基因进行了分离克隆，因此相关基因的表达分析和其他花色苷基因的分离克隆是今后的研究重点。

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Fund project:Supported by national science and technology support project (2011BAD27B01-01-02)and science and technology support program of Xinjiang (2013911073)

Cloning and Sequence Analysis of Anthocyanin Biosynthesis Related Genes (PgANS,PgCHSandPgACT) in Pomegranate (PunicagranatumL.)

WU Zhong-hong1,DU Juan2, Atawulla Tiemuer1, ZHOU Jiang3, XU Jing3, WU Bin1

(ResearchInstituteofAgriculturalProductsStorageandProcessing,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China; 2.XinjiangAgriculturalVocationalCollege，ChangjiXinjiang831100,China； 3.CollegeofFoodandPharmaceuticalSciences,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

【Objective】 To obtainPgANS,PgCHSandPgACTgenes in Kashgar pomegranate kernels and analyze their sequence.【Method】Xinjiang pomegranate in Kashgar was selected as the materials. The total RNA of pomegranate Kernels was extracted with Phenol-chloroform. The first cDNA was synthesized with TIANScript kit，and amplified to cDNA by RT-PCR using special primer. The pMD19-T vector linked with the cDNA fragment was transformed intoEscherichiacoliDH5α, and the positive clone was sequenced.【Result】The fragment ofPgANSwas 474bp, GenBank accession number was KT779433. Compared withPunicagranatumL. which the accession numbers were KF841619,GU376749 on NCBI, thePgANShomology of nucleotide sequence was 99%. At the same time, the sequence analysis demonstrated that the deduced nucleotide sequence shared 85%, 79% and 76% homology with that ofIpomoeabatatas(GU598212),Morusalba(JF499385) andFragariaxananassa(AY695817); the fragment ofPgCHSwas 140bp and thePgACTwas 148bp. Compared withPunicagranatumL. (JF747148, GU376750) on NCBI, thePgCHShomology of nucleotide sequence was 99%, and thePgACTwas 93%.【Conclusion】ThePgANS,PgCHSandPgACTgenes have been obtained, which has laid the foundation for further studying the influence of storage conditions on the anthocyanins ofPunicagranatumL. kernels.

anthocyanin;PgANS;PgCHS;PgACT; clone

2015-11-26

国家科技支撑项目(2011BAD27B01-01-02)；自治区科技支疆项目(2013911073)

吴忠红(1979-)，女，新疆人，助理研究员，博士研究生，研究方向为农产品贮藏与加工，(E-mail)wuzhonghong111@163.com

吴斌(1973-)，男，江苏人，副研究员，博士，研究方向为农产品贮藏与加工，(E-mail)xjuwubin0320@sina.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.01.011

S665.4

A

1001-4330(2017)01-0088-07