植物miRNA靶基因验证研究进展

何炫程, 吕鹤书, 黄捷飞, 马兰青, 杨明峰

北京农学院生物科学与工程学院, 农业部华北都市农业重点实验室, 北京 102206

植物miRNA靶基因验证研究进展

何炫程, 吕鹤书, 黄捷飞, 马兰青, 杨明峰*

北京农学院生物科学与工程学院, 农业部华北都市农业重点实验室, 北京 102206

植物microRNA(miRNA)可以利用碱基互补配对原则对靶基因进行识别并介导靶基因(mRNA)的切割或翻译抑制，以此机制来调控靶基因的表达。主要从作用方式及实验体系两大方面入手，综述了植物miRNA与其靶基因的作用机制，以及植物miRNA靶基因验证方法的研究进展,旨在更深入的探究miRNA与其靶基因的作用关系。

植物miRNA；靶基因；验证

自1993年Lee等[1]和Wightman等[2]分别在研究线虫胚胎发育时发现了19～25个核苷酸组成的非编码单链小RNA以来，就此揭开了研究miRNA的序幕。在植物中，miRNA通过对其相应靶基因进行互补识别，以此来介导靶基因的调控，表现为大部分miRNA对其相应靶mRNA进行切割，只有小部分的miRNA对靶基因进行翻译抑制。这与miRNA和靶mRNA的互补程度有着密切关系。已有研究表明，miRNA通过作用于其相应靶基因，对植物生长发育等诸多方面都具有调控作用[3]。因此，运用适当的方法去验证miRNA与靶基因的关系就显得尤为重要。目前，人们根据植物miRNA作用于靶基因的特点，建立了几种适用于植物miRNA靶基因验证的方法。这些方法从不同角度以及不同方面对靶基因进行验证，现已颇具成效。本文将目前已有的验证方法归纳总结，综述了目前效果最佳及使用较多的验证方法，以期为今后miRNA的研究提供理论基础。

1 miRNA与靶基因作用机制

1.1 miRNA介导靶基因的降解

目前对于miRNA如何介导mRNA的降解有以下两种观点：一种观点认为miRNA具有向导作用，它会把需要降解的mRNA作出标记，之后运送到普通mRNA降解机制中。现阶段在斑马鱼胚胎以及线虫的研究中支持此观点；另一种观点则认为miRNA介导mRNA的降解需要多种相关酶和复合物的参与，如脱腺苷酶复合物、脱帽酶等都可能在此过程中发挥作用。现已经证实，植物中大约有70%的miRNA是介导靶基因切割的。其切割位点处于miRNA的第10～11碱基之间。

1.2 miRNA介导靶基因的翻译抑制

目前对于 miRNA 如何介导 mRNA 翻译抑制的争议较大，具体有以下几种观点：

1.2.1 翻译起始抑制 这种观点认为miRNA导致核糖体无法顺利组装，Chendrimada等[4]认为miRNA可能是通过阻止核糖体组装从而阻断翻译起始。Thermann等[5]的研究也表明miRNA可以全面抑制核糖体的组装，将这种miRNA去除后，核糖体又会重新恢复其功能。

1.2.2 miRNA翻译起始后抑制 在线虫中的实验表明，miRNA及其靶基因可以与一些多聚核糖体结合在一起，miRNA可能通过这些多聚核糖体抑制mRNA的翻译。Petersen等[6]的研究证实了此观点。

1.2.3 翻译的提前终止 这个观点主要是基于Petersen等[6]的实验结果，该研究设置两组mRNA，一组加入miRNA，另一组为对照组。结果表明，实验组靶基因核糖体的解离速度要比对照组更快。由此产生了miRNA引发翻译提前终止的假说。

目前，就验证miRNA介导靶基因翻译抑制的实验来说，其具体机制为当miRNA与靶mRNA的3′-UTR区不完全互补配对，miRNA会结合到靶mRNA 3′-UTR上，从而阻断靶基因mRNA的翻译，进而调节基因表达。

2 靶基因验证方法

现阶段对于miRNA靶基因的验证工作可以从两方面着手：一方面是从miRNA对于靶基因的作用方式入手，主要有miRNA介导靶基因的切割以及靶基因的翻译抑制。当miRNA介导靶基因切割时可以从RLM-5′RACE[7,8]、3′PPM RACE技术[9]、降解组[10]测序入手。当miRNA介导靶基因翻译抑制时主要为报告基因系统。另一方面是针对于验证靶基因的实验体系，可分为瞬时表达和转基因两种方式。

2.1 从作用方式着手的验证方法

2.1.1 利用RLM-5′RACE验证靶基因 Llave等[7]利用植物miRNA介导靶基因切割这一特点，运用改进的RLM-5′RACE(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM RACE)验证植物miRNA靶基因。事实证明，在植物中当miRNA介导靶基因切割时运用其开发的这种方法是可行的，因此被广大研究人员采用。这一方法相对简单、快捷，可在短时间内完成验证工作。但这种方法验证结果单一，每次试验只可验证一种靶基因，对于多种靶基因的同时验证无法完成。其主要原理为:miRNA介导mRNA发生切割后,断裂的mRNA 3′端片段会产生一个暴露的5′磷酸基团,接着使用RNA连接酶在mRNA断口处拼接上一个RNA接头,然后利用反转录引物Oligo (dT)完成反转录。最后利用基因特异性引物(GSP)可以扩增mRNA断口处附近核酸序列,借此来确定切割位点[11]。

2.1.2 利用3′PPM RACE验证靶基因 RLM 5′RACE利用被切割的靶基因的3′端断裂片段进行验证，而3′PPM RACE[Poly (A) polymerase-mediated 3′rapid amplification of cDNA ends]则利用5′端断裂片段进行验证。宋长年[12]和王晨[13]分别利用3′PPM RACE技术验证了各自研究的靶基因。其主要原理为：在mRNA 5′断裂片段的3′端添加Poly(A)尾巴，之后将 5′断裂片段反转录成cDNA，之后将包含切割位点的片段扩增，最后对其切割位点进行检验。此方法相对简单，但由于5′端断裂产物不稳定，容易发生降解，所以3′PPM RACE并不十分常见。

2.1.3 利用降解组测序技术验证miRNA靶基因 上述方法只能验证单一靶基因序列，对于大量的靶基因验证工作就变得无从入手。由于高通量测序技术的迅速发展和更新换代，随之演变出了一种新的对于miRNA靶基因的验证手段, 即降解组测序(degradome sequencing)法[14]。

German等[10]首次运用降解组测序技术成功验证了miRNA的靶基因。降解组测序技术主要由3个步骤组成:构建文库、高通量测序和生物信息学分析。这一方法的主要原理为[15]:miRNA介导mRNA发生切割后,断裂的mRNA 3′端片段会产生一个暴露的5′磷酸基团,在其断口处用RNA连接酶拼接一个RNA接头，然后利用反转录引物Oligo (dT)完成反转录。最后利用基因特异性引物(GSP)将mRNA断口处附近核酸序列扩增。进行酶切后得到长度为20～21 nt的片段，再将此片段与3′双链DNA接头连接并进行PCR扩增, 胶回收纯化后, 得到一个靶基因断裂的3′端切割片段的文库，进行高通量测序后，运用CleaveLand分析软件将得到的序列与目标物种的基因组或cDNA序列进行比对，记录匹配序列，同时去除未比对上的序列，最终能够获得被切割的mRNA的完整核酸序列。

2.2 从实验体系着手的验证方法

现阶段，在植物中验证靶基因的体系可分为瞬时表达和转基因。瞬时表达较稳定表达具有操作简单、实验操作快、实验周期短等诸多优点[16]，转化效率比较稳定，表达水平较高，并且不可稳定遗传，具有很高的生物安全性[17]。

2.2.1 利用瞬时表达系统作为植物miRNA功能的验证体系 赵文婷等[18]选用植物表达载体，依靠此载体表达miRNA；并且选用同样的植物表达载体来表达预测的靶基因与GFP融合蛋白，将这两种载体转化农杆菌后侵染烟草叶片下表皮，之后观察烟草下表皮的荧光现象。此方法简单省时，可以快速、直观地观察生物大分子的功能[19]。

2.2.2 利用转基因系统作为植物miRNA功能的验证体系 贾小云等[20]以miR828过表达转基因番茄和野生番茄为材料，设置正常供磷和缺磷2个处理的培养试验。将野生型和miR828过表达的转基因番茄植株缺磷培养15 d后，观察番茄植株地上部分和地下部分的表型差异。之后利用qRT-PCR分析miR828及其靶基因SlMYB7-like的表达情况。结果显示，miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达受缺磷胁迫诱导。在正常供磷和缺磷条件下，miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量和花青素含量均低于野生型，表明miR828通过靶向SlMyb7-like负调控花青素合成相关基因的表达，进而负调控番茄植株中花青素的生物合成。从而证明了miRNA与其靶基因的相关性。

3 展望

目前分子生物学相关技术正在飞速发展，有关miRNA靶基因的验证方法也在不断更新。但由于miRNA片段较小，且作用机制单一，所以将验证靶基因的方法变得具有局限性。当下绝大部分验证手段均是从靶位点断裂部分着手，但由于miRNA与靶基因关系的不确定性，都为使用这些方法验证靶基因制造了隐患。

就单一的靶基因验证而言，瞬时表达系统以及转基因系统虽然可以验证出miRNA与其靶基因的相关性，但都是从标记基因以及表观现象来进行佐证。若想从分子角度来阐明这种关系，其最终还是要通过RLM 5′RACE等来加以证明。而就现阶段研究来看，直接从植物中验证靶基因已并不多见，大部分都是通过过表达miRNA进行验证。那么，对于多种验证手段的综合应用，已经是当下靶基因研究的发展趋势。如果可以从植物中直接验证目的miRNA的靶基因，将会极大的推进miRNA的研究进程。因此，今后对于直接从植物中高效的验证出低峰度miRNA的靶基因，可能会成为研究的热点。

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Advances on Target Gene Alidation Method of Plant miRNA

HE Xuancheng, LV Heshu, HUANG Jiefei, MA Lanqing, YANG Mingfeng*

KeyLaboratoryofUrbanAgriculture(NorthChina),MinistryofAgriculture,CollegeofBiologicalScienceandEngineering,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China

Plant microRNAs (miRNAs) can recognize the target gene(mRNA) by the principle of complementary pairing and mediate the cleavage or translation inhibition of the target gene, and the mechanism was used to regulate the expression of target genes. In this paper, we reviewed the mechanism of plant miRNA and its target genes, and the research progress of plant miRNA target gene validation methods from two aspects of the function and the experimental system, which was objectived to explore the relationship between miRNA and its target genes.

plant miRNA; target gene; validation

2016-12-07; 接受日期：2017-01-12

国家自然科学基金项目(31370674；31300620)；北京市教育委员会科技计划面上项目(KM201410020001)资助。

何炫程，硕士研究生，研究方向为植物代谢调控。E-mail:1375720631@qq.com。*通信作者：杨明峰，副教授，研究方向为植物代谢调控。E-mail:mfyang@bac.ac.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.02.03