破骨细胞相关MicroRNA研究进展

孔 琦，孙自强，王 东，刘 伟，宋瑞龙，顾建红，刘宗平*

(1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009; 2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

破骨细胞相关MicroRNA研究进展

孔 琦1,2，孙自强1，王 东1，刘 伟1，宋瑞龙1,2，顾建红1,2，刘宗平1,2*

(1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009; 2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

MicroRNA(miRNA)是一种非编码蛋白RNA，其长度约为 22 nt，广泛存在于真核生物细胞中，在生物的生长、发育和疾病发生等生物学过程中发挥着重要作用。随着对miRNA研究的不断深入，其在骨代谢方面的研究也逐渐展开。作为体内唯一一种负责骨吸收的细胞，破骨细胞(OC)在机体骨组织生理及病理性过程中占有重要地位。OC的形成和分化受多种因素调节，研究发现多种miRNA对OC有着调控作用，如miR-21、miR-422a和miR-148a能够促进OC形成，miR-124、miR-155和miR-503则抑制OC形成，除此以外，某些miRNA还能通过OC调控肿瘤骨转移。对这些机制的研究将从另一个层面揭示代谢性骨病的病因，并对临床治疗提供指导。论文对miRNA在OC形成和分化过程中的作用及机制进行综述。

微小RNA；破骨细胞；形成；分化

骨组织是人和动物的重要器官，不仅为肌肉提供附着点，保护内脏器官，而且在调节体内矿物质平衡上发挥着重要作用。破骨细胞(osteoclast，OC)作为体内唯一具有骨吸收功能的细胞，和成骨细胞(osteoblast，OB)共同协调骨吸收与骨形成的动态平衡[1]。目前，认为破骨细胞起源于单核巨噬细胞/单核系造血前体细胞[2]，破骨细胞前体(osteoclast precursors，OCPs)在巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulatory factor，M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor -κB ligand，RANKL)的联合作用下逐步融合为破骨细胞[3]。其他的细胞因子和激素，比如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、性激素(sex hormone)、甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)、1α,25-二羟维生素D3(1α,25-dihydroxyvitamin D3，1,25-(OH)2D3)等也可以影响破骨细胞的分化[4]。

自从1993年Lee R C等[5]在线虫中发现第1个MicroRNA(miRNA)——lin-4以来，miRNA迅速成为生物学领域的研究热点。人们逐渐在人类、小鼠、果蝇等多种生物中开展miRNA的研究，至2014年6月，miRBase(release 21)数据库中已发布28 645种miRNA。随着miRNA在骨代谢方面研究的展开，发现miRNA在成骨细胞生成、软骨细胞生成、增殖、分化和破骨细胞生成中发挥着重要作用[6]。本文就近年来破骨细胞相关miRNA研究进展进行综述，讨论了miRNA在破骨细胞形成和分化过程中的作用及机制。

1 miRNA的生成和作用机制

miRNA是一种单链RNA，长度约为22 nt，它是由DNA转录产生，但并不翻译成蛋白质，而是参与基因转录后水平的调控。miRNA的产生需要经过多个步骤，哺乳动物中基因组DNA在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录产生miRNA的初始转录物(pri-miRNA)，具有典型茎环结构的pri-miRNA经RNase Ⅲ内切酶Drosha与迪格奥尔格综合征关键区域8(DiGeorge syndrome critical region 8，DGCR8)加工后，形成约60 nt～70 nt的pre-miRNA[7]。之后在核质/细胞质转运蛋白Exportin5的作用下运输到细胞质中，并进一步由细胞质中的核酸酶Dicer加工成结构类似于siRNA的双链RNA——miRNA- miRNA*核苷酸二聚体，最后在RNA解旋酶的作用下生成miRNA和miRNA*，其中只有1条链可以选择性的结合到RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)而成为成熟的miRNA，而miRNA*链则被迅速降解[8]。

miRNA主要通过结合到靶mRNA的3′UTR上，从而引起靶mRNA降解或翻译抑制。miRNA与靶mRNA的配对程度决定抑制方式，若为完全互补，则引起mRNA降解，若不完全互补，则是引起翻译抑制，这主要是由 Argonaute蛋白家族完成[9]。miRNA与靶mRNA的3′端UTR不完全互补，使一个miRNA可调节多个基因表达[10]，也有研究发现，miRNA还可与mRNA的5′端UTR结合。随着研究的深入，一些miRNA的新型作用方式将被逐步发现。

2 与破骨细胞相关的miRNA

破骨细胞的分化受到多种细胞因子和转录因子的调控，miRNA在这些因子调控破骨细胞分化的过程中发挥着重要作用。Mizoguchi F等[11]多个团队的体外实验均发现敲除Dicer酶基因后破骨细胞形成减少，骨吸收下降，这些结果表明经Dicer酶加工成熟的miRNA是机体正常骨吸收调控过程所必需的。Kagiya T等[12]研究发现RAW264.7细胞在RANKL诱导分化为破骨细胞的过程中，有52种miRNA表达量差异达到两倍，说明有多种miRNA参与破骨细胞分化的调控。

2.1 促进破骨细胞形成的miRNA

在上述众多miRNA中，miR-21可介导RANKL诱导的小鼠骨髓源巨噬细胞(bone-marrow macrophages，BMMs)破骨细胞分化过程。转录因子c-Fos和PU.1可以分别通过AP-1和PU.1结合miR-21启动子结合位点，从而上调miR-21的表达[13]。Sugatani T等[14]也提出c-Fos/miR-21/PDCD4(programmed cell death 4，程序性细胞凋亡蛋白4)调控破骨细胞分化的正反馈回路，在这一机制中c-Fos上调miR-21的表达，后者会下调PDCD4蛋白的表达，而PDCD4对c-Fos的表达有抑制作用，因此促进了RANKL诱导的破骨细胞形成。该团队还发现miR-21在雌激素调控的破骨细胞生成的过程中也发挥着重要作用，雌激素可以下调miR-21的表达，从而引起miR-21的靶蛋白Fasl表达升高，诱导破骨细胞的凋亡。Pitari M R等[15]发现在黏附于多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)细胞的骨髓间质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)中，骨保护素(osteoprotegerin，OPG) 表达显著下降，miR-21的表达显著升高，抑制miR-21可以减少BMSCs中RANKL的表达，并证明OPG mRNA的3′UTR含miR-21结合靶位，提示miR-21在破骨细胞分化中的重要作用。

曹政等[16]通过RT-qPCR证明绝经期女性中低骨密度组miR-422a的表达显著高于高骨密度组，经生物信息学目的基因分析发现了5种与miR-422a表达呈负相关的基因，即Casitas B-lineage lymphoma proto-oncogene(CBL)、cluster of differentiation 226(CD226)、insulin-like growth factor 1(IGF1)、phosphoprotein associated with glycosphingolipid microdomains (PAG1)、 transducer of ERBB2(TOB2)，这些基因可能与破骨细胞形成相关，表明miR-422a可能是绝经期女性骨质疏松症发生的一种生物标志。

陈超等[17]发现CD14+外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)分化为破骨细胞时miR-148a显著上调，在CD14+PBMCs中过表达miR-148a促进破骨细胞生成，抑制miR-148a则使破骨细胞生成减少。体内试验发现，卵巢摘除(ovariectomy，OVX)小鼠miR-148a沉默表现为骨吸收抑制，骨量增加。miR-148a是通过结合到肌腱膜纤维肉瘤癌基因B型同系物基因(V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B，MAFB)的3′UTR抑制MAFB表达而发挥作用，而MAFB是RANKL诱导破骨细胞生成途径中活化T细胞核因子蛋白1 (nuclear factor of activated T-cells 1，NFATc1)、c-Fos等转录因子的负调控因子。他们还发现系统性红斑狼疮患者CD14+PBMCs中miR-148a水平显著升高，增强了破骨细胞形成，引发低骨密度症状。

2.2 抑制破骨细胞形成的miRNA

Nakamachi Y等[18]发现在佐剂诱导关节炎(adjuvant-induced arthritis，AIA)大鼠模型中，miR-124可以减少滑膜细胞增生、白细胞浸润、软骨及骨组织损伤，pre-miR-124处理AIA大鼠后，破骨细胞数减少，RANKL、整合素β1(integrin β1，ITGB1)、NFATc1表达下降。荧光素酶试验证明在NFATc1、ITGB1、特异性蛋白1(specificity protein 1，Sp1)以及CCAAT增强子结合蛋白α mRNA的3’UTR上都有miR-124的靶位，在RAW264.7分化为破骨细胞和人破骨细胞分化的过程中pre-miR-124都会抑制NFATc1的表达从而负调控破骨细胞分化。同时，也有报道miR-124对破骨细胞前体的迁移和增殖有影响，这与迁移相关蛋白RhoA和Rac1的表达下降相一致。因此，miR-124可以通过抑制破骨细胞前体的分化和迁移参与破骨细胞形成的调控。

Mann M等[19]发现在RAW264.7分化为巨噬细胞的过程中miR-155的表达量显著升高，而向破骨细胞分化时则明显下降。进一步的研究证明，miR-155通过抑制小眼畸形相关转录因子(microphthalmia transcription factor，MITF)的表达从而抑制破骨细胞分化。Zhang J等[20]研究证明在干扰素β(interferon β，IFN-β)抑制破骨细胞分化的机制中，miR-155发挥着重要作用。IFN-β可以诱导miR-155 生成，而后者可以通过对细胞因子信号传导抑制蛋白1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)和MITF的抑制作用下调破骨细胞形成。

Chen C等[21]发现与健康的绝经后女性相比，患有骨质疏松症的绝经后女性破骨细胞CD14+PBMCs中miR-503的表达显著降低，而过表达miR-503后PBMCs分化为破骨细胞的过程被显著抑制，沉默miR-503则使破骨细胞生成上调，在这一调控机制中RANK是miR-503的调节靶位。

2.3 与肿瘤骨转移相关的miRNA

破骨细胞在肿瘤骨转移中也发挥了重要的作用。现已发现一些miRNA除参与破骨细胞分化外，还参与肿瘤进程。Ell B等[22]发现在正常生理条件或病理性肿瘤条件下，破骨细胞形成过程中miR-33a、miR-133a、miR-141、miR-190、miR-219这5种miRNA的表达均显著下调。其中miR-141和miR-219分别通过与MITF/Calcr和MITF/TRAF6作用抑制破骨细胞分化和骨吸收，这两种miRNA应用于乳腺癌模型小鼠都能降低转移性肿瘤的发生。IL-11是一种溶骨因子，miR-204，miR-211，miR-379可抑制骨转移性乳腺癌细胞中TGF-β诱导产生的IL-11的量[23]。Krzeszinski J Y等[24]发现miR-34a缺失在乳腺癌和黑色素瘤等肿瘤的骨转移过程中有着重要作用，抑制破骨细胞miR-34a的表达可以促进骨转移，过表达miR-34a则会使骨转移受抑制，miR-34a可以通过抑制转化生长因子β诱导因子2(transforming growth factor beta-induced factor 2，Tgif2)——一种促破骨细胞生成的转录因子从而抑制破骨细胞分化，这些发现都表明破骨细胞miR-34a功能的缺失在肿瘤骨转移中扮演着重要角色。

2.4 其他相关miRNA

Sugatani T等[25]研究发现miR-223的表达在破骨细胞分化中发挥重要作用，过表达miR-223，会使抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色阳性多核细胞的形成受到完全抑制，但后续研究发现抑制miR-223同样会使破骨细胞形成减少，由此提出一个正反馈回路，即PU.1促进miR-223的表达，进而抑制核因子I-A (nuclear factor I-A，NFI-A)表达，导致巨噬细胞集落刺激因子受体(macrophage colony stimulatory factor receptor，M-CSFR)和PU.1表达上调，说明miR-223参与破骨细胞分化的双向调控，适度的表达水平对破骨细胞正常分化具有重要作用。

miR-29家族包括miR-29a、miR-29b和miR-29c。Mott J L等[26]发现NF-κB转录起始位点存在miR-29结合位点，而且NF-κB活化会抑制miR-29b-1和miR-29a启动子功能，因此研究者推测miR-29可能参与破骨细胞形成。Wang F S等[27]发现糖皮质激素引发的骨质疏松症与miRNA-29a的表达下降有关，体内试验与体外试验增加miR-29a表达都可以显著缓解糖皮质激素诱发的骨量流失，而敲除miR-29a会增强破骨细胞的骨吸收作用，这一机制可能涉及Wnt和Dkk-1这两个信号途径。Rossi M等[28]在诱导CD14+造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)分化为破骨细胞的体系中，miR-29b通过抑制c-Fos的表达同样发挥负调控破骨细胞分化的作用。但是也有研究呈现不同的结果，Franceschetti T等[29]证明miR-29家族可以通过对NFI-A与Calcr mRNA的影响，促进破骨细胞形成及骨吸收作用。抑制miR-29会减少破骨细胞形成，而敲除miR-29a后原代骨髓细胞和RAW264.7诱导产生的破骨细胞显著变小，敲除miR-29还会降低破骨细胞前体的迁移能力。因此，miR-29调控破骨细胞分化有着复杂的作用机制。

3 展望

miRNA已被证明参与许多生物功能的调控，对破骨细胞相关miRNA的研究仍处于起步阶段，还有更多的miRNA有待发现，其影响破骨细胞分化的分子机制也有待进一步深入研究。目前，对miRNA的研究还局限在单个miRNA的功能。破骨细胞分化过程中不同的miRNA是如何相互协调的？某些疾病的进程是否会通过miRNA影响破骨细胞的形成？怎样利用miRNA为骨代谢性疾病及其他病症提供预警？如何开发miRNA在骨代谢性疾病中的治疗潜力？本文也只是对部分破骨细胞相关的miRNA做了一个浅显的介绍，关于破骨细胞中miRNA的研究还有很长的路要走，进一步研究其调控机制，将为代谢性骨病的临床治疗开辟新的领域。

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Advance in Osteoclast Related MicroRNAs

KONG Qi1,2,SUN Zi-qiang1,WANG Dong1,LIU Wei1,SONG Rui-long1,2, GU Jian-hong1,2,LIU Zong-ping1,2

(1.CollegesofVeterinaryMedicine,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu,225009,China; 2.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,Yangzhou,Jiangsu,225009,China)

MicroRNA,a class of noncoding RNA,has approximately 22 nucleotides and exists in eukaryotic cells widely.It is demonstrated that miRNAs play an important role in physiological prosesses of organism such as growth,development and occurrence of disease.With the deep research,how miRNAs affect bone metabolism is going to be clear.As the unique cell responsible for bone resorption,osteoclast (OC) is an important participator in physiological and pathological processes of bone tissue.The formation and differentiation of osteoclast is regulated by multi factors,such as various miRNAs.miR-21,miR-422a and miR-148a can promote the differentiation of OC,while miR-124,miR-155 and miR-503 suppress the formation of OC,some miRNAs can also mediate tumor bone metastasis via OC. Study of these mechanisms will reveal the causes of metabolic bone disease on another level and provide guidance for clinical treatments.This paper reviewed the functions and mechanisms of miRNAs in the formation and differentiation of osteoclasts.

miRNA; osteoclast; formation; differentiation

2016-08-27

国家自然科学基金项目(31672620，31372495，31302154)；江苏省高校自然科学基金项目( 13KJB230002)；高等学校博士学科点专项科研基金项目(20133250120002)；江苏高校优势学科建设工程资助项目

孔 琦(1992-)，男，江苏南京人，硕士研究生，主要从事动物营养代谢病与中毒病研究。*通讯作者

S852.1

A

1007-5038(2017)02-0086-05