乌苏里拟鲿微卫星文库的构建及分析

朱传坤潘正军王 辉吴 楠常国亮丁怀宇周凤建,

(1. 淮阴师范学院生命科学学院, 江苏省特色水产繁育工程实验室, 淮安 223300; 2. 淮阴师范学院江苏省区域现代农业与环境保护协同创新中心, 淮安 223300; 3. 江苏省淮安市水产技术指导站, 淮安 223001)

乌苏里拟鲿微卫星文库的构建及分析

朱传坤1,2潘正军1,2王 辉1,2吴 楠1,2常国亮1,2丁怀宇1,2周凤建2,3

(1. 淮阴师范学院生命科学学院, 江苏省特色水产繁育工程实验室, 淮安 223300; 2. 淮阴师范学院江苏省区域现代农业与环境保护协同创新中心, 淮安 223300; 3. 江苏省淮安市水产技术指导站, 淮安 223001)

乌苏里拟鲿(Pseudobagras ussuriensis)又名乌苏里(Leiocassis ussuriensis), 隶属于鲶形目, 鲿科, 拟鲿属,主要分布于我国东北地区, 但在我国其他各大水系也有分布[1]。乌苏里拟鲿肉质细嫩、味道鲜美、风味独特、适口性好、市场价值高, 深受广大消费者和养殖户青睐。在20世纪80年代, 乌苏里拟鲿的天然捕捞量曾仅次于同科的黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidsco), 然而由于捕捞强度的持续增长、环境污染及生境破坏等因素的影响,其野生资源量锐减, 目前在很多自然分布区已很难捕获野生个体[2]。

目前已有较多针对乌苏里拟鲿的研究报道, 其中大多数研究集中于其人工繁殖[3,4]、人工养殖[5]、营养及生理[6,7]等方面, 关于其遗传学的相关研究则鲜有报道, 仅有少量利用同工酶、RAPD、线粒体DNA及SRAP等标记对其进行群体遗传多样性分析的研究报道[8—11]。微卫星标记是由2—6碱基为重复单元的串联重复序列, 根据串联重复连续与否, 可分为完美型、非完美型及复合型微卫星三类[12]。微卫星标记不仅在真核生物基因组中分布广泛, 而且具有多态性高、可重复性强及共显性遗传等优点[12], 在水产动物遗传学和基因组学研究中被广泛应用[13]。然而, 目前尚无利用微卫星标记对乌苏里拟鲿进行种质资源和遗传结构分析的相关报道, 原因可能主要是由于该物种微卫星标记的缺乏。因此, 本研究采用磁珠富集法构建了乌苏里拟鲿基因组微卫星富集文库,并对文库的微卫星富集效率及特征进行了评估和分析,同时, 从中开发了一批多态性微卫星标记。本研究结果将为今后乌苏里拟鲿中基于微卫星标记的种质资源保护、遗传图谱构建及分子标记辅助育种等研究工作的开展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样本采集及DNA抽提

本研究所用32尾乌苏里拟鲿样本均于2015年5月采自江苏省淮安市水产技术指导站, 每尾个体剪取尾鳍组织并保存于无水乙醇中, 基因组DNA抽提采用传统的苯酚-氯仿法进行[14]。

1.2 基因组酶切及片段筛选

取50 ng/μL的基因组DNA 10 μL, 加入5 U限制性内切酶Mse I (NEB), 于37℃水浴中消化3h, 酶切产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳, 并利用DNA纯化试剂盒(康为世纪)回收纯化250—800 bp的DNA片段。之后, 将等体积的上、下游接头引物Mse I-A: 5′-GACGATGAG TCCTGAG-3′和Mse I-B: 5′-TACTCAGGACTCAT-3′混合, 并于95℃变性5min, 缓慢冷却至室温后, 即制备成终浓度50 μmol/L的连接接头。利用T4 DNA连接酶(Promega)将所回收的DNA片段和新制备的连接接头于16℃生化培养箱中过夜连接。连接产物稀释10倍后利用引物Mse I-N: 5′-GATGAGTCCTGAGTAAN-3′进行预扩增, PCR反应体系总体积为25 μL, 包含: MseI-N引物(10 μmol/L) 0.8 μL, 10×Taq Buffer (不含Mg2+) 2.5 μL, MgCl2(25 mmol/L) 1.6 μL, dNTPs (10 mmol/L) 0.4 μL, 模板DNA 1 μL, Taq DNA聚合酶(Promega) 0.2 μL (5 U/μL),灭菌超纯水18.5 μL。PCR反应条件为: 94℃预变性3min, 94℃变性1min, 53℃退火1min, 72℃延伸1min, 经N (N=14、17、20、23、27、30)个循环, 确定最佳循环次数为17; 72℃延伸5min, 通过1.0%琼脂糖凝胶电泳后, 再次进行切胶和纯化, 从而获得大量250—800 bp的DNA片段。

1.3 生物素探针杂交

取1.2中PCR预扩增纯化产物29 μL与1 μL生物素标记的(GT)13探针(5′-bio-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGT, 100 μmol/L)及70 μL杂交缓冲液(6×SSC+0.1% SDS)配制成总体积100 μL的杂交反应体系, 于95℃变性5min, 65℃退火1h, 再缓慢冷却至室温, 从而使预扩增产物中含微卫星的片段和(GT)13探针充分杂交。

1.4 磁珠富集

取150 μL链霉亲和素包被的磁珠(Promega), 用 300 μL TEN100溶液(10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, pH 7.5)在室温下洗涤3次, 每次5min,清洗后用300 μL的TEN100溶液悬浮磁珠。将1.3中获得的杂交产物和预处理的磁珠在室温下混匀, 放置30min进行磁珠杂交反应。磁珠杂交完成后利用磁力架固定磁珠, 移去杂交混合液。用400 μL TEN1000缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, 1 mol/L NaCl, pH 7.5)在室温下对磁珠进行非严谨洗脱, 共洗脱3次, 每次5min。之后, 用洗涤液400 μL (0.2×SSC+0.1% SDS)于室温下对磁珠进行3次严谨洗脱, 每次5min。最后, 加入50 μL TE缓冲液(pH=8.0)于沸水中处理磁珠5min, 并迅速固定磁珠吸取上清液, 之后重复进行一次洗脱, 最终获得两次洗脱的单链目的DNA片段。

1.5 目的片段的扩增和回收

分别以两次洗脱获得的单链目的DNA片段为模板, MseI-N为引物, 对目的片段进行扩增以获得双链目的DNA片段, PCR扩增体系和程序同1.2。将两次洗脱片段的预扩增产物通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳后, 切取250—800 bp的片段并利用DNA纯化试剂盒进行纯化。

1.6 目的片段的克隆及阳性克隆筛选

将1.5中获得的纯化PCR产物连接入pMD18-T载体中(TaKaRa), 并转化入DH5α感受态大肠杆菌菌株中, 于含氨苄青霉素的固体LB培养基上进行过夜培养, 从而获得乌苏里拟鲿的微卫星富集文库。

挑取单克隆于150 μL含氨苄青霉素的液体LB培养基中, 并于37℃摇床中以200 r/min速度振荡培养24h。克隆培养结束后, 利用M13通用引物(-47与-48)对每个克隆进行PCR扩增和1.0%琼脂糖凝胶电泳检测, 挑选扩增片段大小在250—800 bp的克隆送测序公司测序。

1.7 微卫星引物设计及多态性筛选

克隆测序结果获得后, 利用SSRhunter软件中的默认参数对每条序列进行微卫星搜寻, 并辅以人工查找和校正。对含有微卫星序列的片段, 采用Primer Premier 5.0软件进行引物设计, 并送上海生工合成。合成好的引物在32尾乌苏里拟鲿样本中进行PCR扩增效果检测及多态性筛选, PCR反应体系总体积为12.5 μL, 包含10×Taq Buffer (含Mg2+)1.3 μL, dNTP 0.4 μL(2.5 mmol/L), 上、下游混合引物0.4 μL(2.5 μmol/L), 模版DNA 1 μL (50 ng /μL), Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.1 μL, 灭菌超纯水9.3 μL。PCR产物利用10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分型, 以PBR322/MspI(天根生物)作为标准DNA, 凝胶通过溴化乙锭(EB)染色及凝胶成像系统拍照后进行多态性判断和分析。

2 结果

2.1 微卫星富集文库克隆阳性率检测

利用菌落计数器估算, 所构建微卫星富集文库中共获得克隆约3000个, 随机挑选其中233个进行了阳性检测。通过检测发现, 其中有224个为阳性单克隆, 7个为阳性双克隆, 2个为假阳性克隆, 因此, 本文库的阳性率达到99.1%。

2.2 文库微卫星富集效率

将随机挑选的208个阳性单克隆进行了测序, 其中16个由于抽提质粒失败而未获得测序结果, 最终共获得序列192条。通过微卫星序列查找后, 发现在192条序列中, 含有微卫星的序列共有162条, 占序列总数的84.4%,即该文库的微卫星富集阳性率为84.4%。

2.3 微卫星序列分析

本研究获得的162条含微卫星序列中, 有91条(56.2%)为完美型微卫星序列, 39条(24.1%)为非完美型, 32条(19.8%)为复合型序列。这些序列中共有微卫星位点271个, 平均每条序列含微卫星1.68个, 大部分序列(64.8%)含有一个微卫星位点, 也有少量序列微卫星位点数较多(6.2%), 其中最多的含有10个微卫星位点(图1A)。重复单元以GT/TG和CA/AC类型为主(75.0%), 但同时也发现了其他两碱基及三、四碱基重复类型(图1B), 甚至还发现了重复单元为12—40碱基的6条小卫星DNA序列。微卫星的重复次数介于5—81, 其中重复次数大于10次的有171个(62.9%), 重复次数大于30的有33个(12.2%)(图 1C),

2.4 微卫星引物设计与多态性筛选

在162条含微卫星的序列中, 有15条侧翼序列太短,无法设计引物。在147条含有足够侧翼长度的序列中, 随机挑选了20条进行引物设计, 并将这20对引物在32尾乌苏里拟鲿个体中进行了PCR及电泳检测。结果表明, 20对引物中有17对能扩增出稳定条带, 其中有8对呈现出良好的多态性(表 1、图 2), 多态性比例为40.0%。

3 讨论

3.1 微卫星文库富集效率

微卫星标记具有分布广泛、稳定性好、多态性高、可重复性强、共显性遗传等诸多优点, 在群体遗传结构分析、遗传背景分析、种质资源评估、基因鉴定、遗传连锁图谱构建、数量性状位点定位及分子标记辅助育种等方面具有广泛应用。因此, 微卫星标记的开发是其应用研究的基础环节, 目前主要可通过4种途径获得微卫星标记。(1)磁珠富集法。该方法是目前微卫星标记开发的主流方法, 通过构建微卫星磁珠富集文库, 进行微卫星标记筛选。其微卫星标记开发效率高, 目的性强, 因此被广大研究者广泛采用, 已在鳙(Aristichthys nobilis)[15]、胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)[16]、兰州鲇(Silurus lanzhouensis)[17]等多种鱼类中成功应用。(2)数据库筛选法。在公共数据库中下载目的物种已发表的EST或DNA序列,从中进行微卫星标记的筛选。虽然该方法具有成本低、耗时短及工作量较小的优点, 但对于公共数据库中序列资源贫乏的物种来说, 该方法并不适用。(3)跨种扩增法。通过近缘物种已发表的微卫星标记的跨种扩增来筛选目的物种的微卫星标记。该方法具有和公共数据库筛选法相同的优点, 但该方法的应用前提是近缘物种中已有微卫星标记的报道, 若亲缘关系太远, 则该方法的效率较低。(4)高通量测序法。该方法主要是通过基因组和转录组的高通量测序, 从测序序列中筛选微卫星标记, 该方法成本相对较高。由于目前公共数据库中乌苏里拟鲿的核苷酸序列极少, 同时, 拟鲿属的近缘物种中也鲜有微卫星的相关报道, 因此, 采用主流的磁珠富集法构建微卫星文库, 是在乌苏里拟鲿中开发微卫星标记经济、有效的手段。

图 1 乌苏里拟鲿微卫星文库中微卫星位点特征分析Fig. 1 Characterization of microsatellites in the enriched library of Pseudobagrus ussuriensisA. 每条序列中含微卫星数目的比例分布; B. 各重复类型微卫星的比例分布; C. 微卫星重复次数频率分布A. Proportion of microsatellite numbers in each sequence; B. Proportional distribution of microsatellites with different repeat motifs; C. Frequencies of microsatellites with different core motif

已有研究表明, 在真核生物基因组中, (CA)n或(GT)n重复类型的微卫星含量最为丰富[18], 因此, 为获得更高的微卫星富集效率, 本研究选用(GT)n重复探针类型, 同时为了防止探针长度过长影响杂交效率, 采用长度适中的(GT)13作为杂交探针进行富集文库构建。本研究构建的微卫星富集文库的微卫星富集效率达到了84.4%,与合浦珠母贝(Pinctada fucata)(83.2%)[19]类似, 低于银鲫(Carassius auratus gibelio)(95.3%)[20], 但高于大多数已报道水产动物中的富集效率, 如胭脂鱼(40.0%)[16]、兰州鲇(63.0%)[17]、鳜(Siniperca chuatsi)(66.7%)[21]、刀鲚(Coilia ectenes)(69.4%)[22]等。影响阳性率的因素有很多, 如实验所用试剂、操作者的熟练程度及洗脱温度和时间等差异都可能影响最终的阳性率; 另外, 探针的类型也是影响阳性率的重要因素, 若所用探针的微卫星重复类型在目的物种基因组中的丰度太低或重复次数不合理, 都会影响杂交效率, 进而影响微卫星富集效率。因此, 为提高富集效率, 有学者提倡采用多种探针进行微卫星富集文库的构建[23], 该方法已在多种水产中得到应用[17,24,25]。本研究虽然以GT重复类型作为探针, 但获得的微卫星中除GT/CA重复类型外, 也发现了其他重复类型, 如CT/AG及三、四碱基重复类型, 类似结果在其他水产动物中均有报道[16, 22, 26]。

表 1 20个乌苏里拟鲿微卫星位点的引物信息Tab. 1 Information for 20 microsatellite loci of Pseudobagras ussuriensis

图 2 微卫星文库中3个多态性标记在32尾乌苏里拟鲿中的电泳检测图谱Fig. 2 Electrophoretic results of 3 polymorphic microsatellites in 32 individuals of Pseudobagrus ussuriensisA. PuGT04电泳图; B. PuGT05电泳图; C. PuGT32电泳图A. Electrophoretogram of PuGT04; B. Electrophoretogram of

3.2 微卫星组成特点

本研究获得的162条含微卫星序列中, 完美型、非完美型和复合型所占比例分别为56.2%、24.1%和19.8%,可见完美型微卫星为主要类型, 该结果也与兰州鲇[17]、黑斑原鲦(Glyptosternum maculatum)[26]、中国鲎(Tachypleus tridentatus)[27]及合浦珠母贝[19]等水产动物具有相似的微卫星组成特点。由于微卫星本身的结构特点, 其复制滑动及点突变频率均较高[28,29], 完美型微卫星可能主要由核心重复区的复制滑动产生, 而非完美型则可能是由核心重复区的点突变导致, 相对于点突变, 复制滑动的概率可能更大些, 因此完美型微卫星的比例在已报道物种中总是最高的。

一般来说, 重复次数低于5 的微卫星很少会检测出多态性[30], 因此, 微卫星位点的核心重复次数至少为5次,重复次数越多, 该位点的多态性也就越高[12], 但在真核生物中微卫星核心重复大多小于30次, 如本研究中重复次数小于30次的微卫星所占比例为87.8%。因此, 微卫星核心重复次数可反映相应位点的多态性信息, 然而, 重复次数过多会导致测序结果侧翼序列过短, 造成引物设计困难, 本研究中15条无法设计引物的序列多数属于此类情况。在随机合成的20对引物中, 有17对可扩增出稳定清晰的目的条带, 其中8对在32尾乌苏里拟鲿中表现为多态性, 引物扩增成功率高于刀鲚[22]、兰州鲇[17]及太湖新银鱼(Neosalanx taihuensis)[24]等物种, 多态性比例与兰州鲇[17]相当, 高于刀鲚[22]、宽口光唇鱼(Acrossocheilus monticola)[25]等物种, 低于太湖新银鱼[24]等。影响扩增成功率的主要原因可能在于引物设计的成功与否, 而引物多态性比例则和物种本身的多样性及用于多态性检测的样本的遗传背景相关。

4 结论

本研究首次构建了乌苏里拟鲿微卫星富集文库, 该文库不仅克隆阳性率高, 而且微卫星阳性率也处于较高水平, 因此, 利用该文库可以达到高效开发微卫星标记的目的。本研究结果将有助于推动乌苏里拟鲿的遗传结构分析、遗传连锁图谱构建、数量性状位点定位及分子标记辅助育种等研究工作的进程。

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[30]Valdes A M, Slatkin M, Freimer N B. Allele frequencies at microsatellite loci: the stepwise mutation model revisited [J]. Genetics, 1993, 133(3): 737—749

CONSTRUCTION AND ANALYSIS OF AN ENRICHED MICROSATELLITE LIBRARY IN PSEUDOBAGRAS USSURIENSIS

ZHU Chuan-Kun1,2, PAN Zheng-Jun1,2, WANG Hui1,2, WU Nan1,2, CHANG Guo-Liang1,2, DING Huai-Yu1,2and ZHOU Feng-Jian2,3
(1. Jiangsu Engineering Laboratory for Breeding of Special Aquatic Organisms, School of Life Science, Huaiyin Normal University, Huai’an 223300, China; 2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Regional Modern Agriculture & Environmental Protection, Huaiyin Normal University, Huai’an 223300, China; 3. Huai’an Fisheries Technical Guidance Station, Huai’an 223001, China)

乌苏里拟鲿; 磁珠富集文库; 微卫星

Pseudobagras ussuriensis; Magnetic beads-enriched library; Microsatellite

Q781

A

1000-3207(2017)02-0473-06

10.7541/2017.59

2016-06-15;

2016-10-24

江苏省区域现代农业与环境保护协同创新中心项目(HSXT307); 淮阴师范学院博士科研启动项目(31ZCK00); 国家自然科学基金项目(31602146)资助 [Supported by Jiangsu Collaborative Innovation Center of Regional Modern Agriculture & Environmental Protection (HSXT307), the Start-up Funds of Scientific Research for Dr. C. Zhu from Huaiyin Normal University (31ZCK00) and the National Natural Science Foundation of China (31602146)]

朱传坤(1984—), 男, 山东临沂人; 讲师; 主要从事鱼类基因组学与分子标记辅助育种研究。E-mail: zhuchuankun@hytc.edu.cn