单细胞分析研究进展

石 蒙, 宋志花, 耿旭辉, 吴大朋, 关亚风*(. 中国科学院大连化学物理研究所, 中国科学院分离分析化学重点实验室, 辽宁 大连 6023; 2. 中国科学院大学, 北京 00049)

邹汉法研究员纪念专辑(下)·专论与综述

单细胞分析研究进展

石 蒙1,2, 宋志花1,2, 耿旭辉1, 吴大朋1, 关亚风1*
(1. 中国科学院大连化学物理研究所, 中国科学院分离分析化学重点实验室, 辽宁 大连 116023; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

单细胞分析可以揭示生命基本单元——细胞物质组成、生理行为的多样性和差异性,是当今生命分析的主流前沿技术。同时,也对分析技术的定量检测极限、分辨率和精密操控能力提出了新挑战。文章着重从单细胞分离、检测、成像等几个主要方面,综述了单细胞技术研究的最新进展,并对分离和检测技术的发展作了展望。

单细胞;分离;检测;成像;综述

细胞是生物体形态结构和生命活动的基本单位。细胞在增殖、分化和代谢的过程中内因和外因共同作用,造就了细胞之间的差异性。即使是同源的两个细胞,细胞内物质组成和含量也会有很大差异[1]。而群体细胞分析只能给出一个稳态的平均结果,无法表征细胞间的差异性。因此,在单细胞水平上对细胞中物质组成及细胞形态进行研究,对揭示细胞间的差异性和解释某些生理行为具有重大意义。

单细胞分析技术应具备高灵敏度、高选择性、高时空分辨等特点,原因如下:(1)单细胞的尺寸小。一般哺乳动物细胞的直径约为10～20 μm,体积在pL级;植物细胞的直径在～100 μm,体积在～1 nL。如此小的尺寸给单细胞的获取和样品前处理操作造成极大的困难。(2)单细胞中的物质含量极低(zmol～fmol),这就需要更加灵敏的检测方法。(3)单细胞中组分十分复杂,组分之间的浓度差异较大,跨度达9个数量级[2],因此存在基质干扰问题,进一步增加了检测难度。(4)细胞在新陈代谢的过程中一直在不断地变化,需要具有高时空分辨的技术来反映细胞的实时变化。

近来,细胞研究已深入到亚细胞甚至单分子水平。本文着重在分离(高效液相色谱、毛细管电泳)、检测(激光诱导荧光、质谱、电化学)、成像(超分辨显微成像、拉曼光谱成像)等几个主要方面对单细胞分析技术的进展进行综述,并作简要展望。

1 分离技术

细胞内源物质组成极度复杂且浓度范围极宽,例如最简单的血红细胞也包含数千种物质,浓度范围跨度达9个数量级[2]。若要检测细胞内痕量分子甚至数个分子,必须消除基质干扰,而分离是实现复杂体系中目标物质定量检测的前提。

1.1 高效液相色谱(HPLC)

高效液相色谱由于具有较高的分离效率,一直被广泛应用于复杂生物样品分析。最初,Jorgenson等[3]利用毛细管开管柱液相色谱对单个神经元细胞进行分离,并利用电化学方法检测其中的神经递质。随后,他们又利用微柱液相色谱技术对单个牛肾上腺骨髓细胞中的去甲肾上腺素、肾上腺素、苯乙醇胺、N-甲基转移酶等物质进行分离检测[4]。Yu等[5]采用HPLC/ESI-MS/MS技术实现了单细胞中谷胱甘肽的测定。超长微柱液相色谱也已用于单细胞的分离分析:Cha等[6]利用创建的一维和二维多孔层开管毛细管柱-电喷雾质谱分析平台进行蛋白质组学分析。宫颈癌细胞中的237个肽段以及163个蛋白质被成功鉴定。此外,毛细管填充柱、整体柱、开管柱液相色谱技术等都被陆续应用于单细胞分析。综合色谱柱样品容量和总分离效率,柱内径为50 μm甚至更小、总柱效≥3万塔板的微柱,才可能为低浓度目标组分的分析提供基本的分离条件。

1.2 毛细管电泳(CE)

毛细管电泳技术具有很高的分离效能,可对单细胞内复杂组分实现高效分离。由于毛细管电泳的进样体积与细胞体积相当,并可以与电化学、激光诱导荧光、质谱等检测技术联用,使之成为单细胞分析的有力工具[7,8]。Wightman等[9]将毛细管电泳和快速循环伏安法相结合,可以对单个细胞所释放的神经递质进行检测。Nemes等[10]利用CE-ESI-MS技术,对海蜗牛神经细胞中50种内源化合物进行了分离鉴定,并对6种神经元细胞代谢物的相似度进行评价。随后,Nemes等[11]又采用CE-ESI-MS (TOF)平台对海蜗牛和小鼠神经元细胞中的300种代谢物进行分离鉴定,充分揭示了不同类型神经元细胞间的代谢物差异。此方法还可应用于细胞器内的代谢物定量分析。随后Sweedler研究组[12]又利用CE-ESI-MS平台对海蜗牛神经元细胞中的15种内生核酸及其衍生物分离后进行定量检测。此方法对于三磷酸腺苷等物质具有良好的分离重现性和较高的灵敏度。Dovichi研究组[13]采用二维电泳对单个小鼠巨噬细胞中的多种蛋白质实现了快速分离,对相关蛋白质的检出限达zmol,并揭示了细胞间组分表达的差异。微流控芯片与电泳技术结合,可以将单细胞样品前处理步骤包括细胞的获取、进样、融膜、电泳分离集成于一个微小的芯片上,极大地提高了单细胞分析的自动化操控水平[14]。Mellors等[15]发展了一种自动化的单细胞分析芯片,将其与ESI-MS相结合,从血红细胞中成功分离出血红素和α、β亚基,检测通量可以达到12细胞/min。Zare等[16]所制作的微流控芯片可以对哺乳动物单细胞内蛋白实现单分子计数,也可对单个蓝藻细胞中的β2肾上腺素能受体进行定量分析。毛细管电泳与质谱联用技术的进一步发展,也将为单细胞内组分鉴定带来促进作用[17,18]。毛细管电泳技术在20世纪90年代开始被用于单细胞分析,但由于其重现性较差,因此发展较慢。将此技术与微流控芯片相结合可以极大地提高分析的重现性和分析通量。有些高度集成化的微流控芯片可以连续实现单细胞筛选、捕获、标记、分离与检测等操作。但芯片上的毛细管电泳柱分离柱效是有限的,所以,将芯片与传统毛细管电泳结合可有效解决实际样品分析问题[19]。

2 检测技术

单细胞中目标物质的绝对量通常很低,一般在fg以下,甚至是zg水平。因此,高灵敏检测是单细胞分析的必要条件。其中,激光诱导荧光、质谱、电化学检测最为常见。

2.1 激光诱导荧光检测技术

激光诱导荧光(LIF)具有极高的灵敏度,是特殊搭建的高灵敏检测装置,其检测极限可达单分子水平[20],但是多数科研级LIF的检测下限是30～100个荧光分子,且搭建高灵敏度激光诱导荧光检测器的成本较高。Deng等[21]构建了毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)分析系统,用于探究单个癌细胞对阿霉素(DOX)的吸收行为,研究结果表明:细胞群体内单个细胞对DOX的吸收含量存在较大差异性,RSD值在24.0%～61.1%之间。Yang等[22]采用CE-LIF技术对单细胞所释放的一氧化氮进行检测,检出限可达42 amol。Wang等[23]利用CE-LIF分析细胞中的脂质代谢物,对于荧光标记的鞘脂类和多磷酸肌醇化合物的检出限可达到10-18～10-20mol,并且该方法显示了较高的重现性。Zhang等[24]用抗原-异硫氰酸荧光素复合物对细胞中的干扰素进行标记,利用CE-LIF进行分离检测,能够定量检测单个自然杀伤细胞(natural killer cell)中的两种干扰素,检出限达zmol。随着衍生化试剂和光学检测系统的不断完善,LIF将具有更高的灵敏度和更加广阔的应用空间。

2.2 质谱检测

质谱作为一种非标记检测技术在单细胞分析方面发挥着重大作用。特别是质谱成像在近年来飞速发展,已被用于单细胞内蛋白质、多肽、脂质、糖类、代谢物、药物等的空间分布研究[25]。目前,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和二次粒子质谱(SIMS)成像是最常用的单细胞质谱分析技术。Boggio等[26]利用MALDI成像对真核细胞实现了10 μm的空间分辨率。为了进一步提高质谱成像的分辨率,Zavalin等[27]设计了一款可几何转换的真空离子源,用于样品的多向激光照射,成功实现了细胞和组织在亚细胞尺度的空间分辨。随后,他们又利用MALDI成像技术对HEK-293细胞内的脂质实现了亚微米级的空间分辨,并且获得了人胰岛细胞内多肽的亚细胞轮廓。SIMS单细胞分析主要集中在疾病诊断[28]、细胞膜上胆固醇和脂质分布、哺乳动物细胞内RNA的亚细胞分布监测[29]。最近,Steinhauser等[30]将多同位素质谱成像和nanoSIMS技术相结合,对细胞内DNA进行成像,为细胞分裂过程中DNA的随机分配提供可靠的实验数据。但对细胞中含量极低且离子化效率比较低的分子,无法依靠质谱来检测;另外,单细胞质谱直接分析技术的时间和空间分辨率还比较有限。但是,随着质谱的空间分辨率和灵敏度的不断提高,其在单细胞研究中将会发挥更大的作用。

2.3 电化学检测

电化学检测(ECD)灵敏度高(fmol),电极尺寸小(亚微米),时间分辨率高(毫秒),特别适合单细胞微环境实时监测[31]。Zhang等[32]采用ECD方法测定了单个鼠细胞中多巴胺的释放情况。检测到不同细胞释放的多巴胺的含量在0.29～1.28 fmol之间,揭示了相同培养条件下不同细胞表达的差异性。纳米尺寸电极可将其对单细胞的扰动降至最低[33]。Li等[34]在2015年发展了一种非常灵敏的电化学检测方法,将纳米电极插入PC 12细胞中,精确测得了细胞囊泡中游离儿茶酚胺的浓度,并证明儿茶酚胺在囊泡内部的浓度要高于囊泡外部的浓度。Li等[35]将纳米电极插入突触间隙中,用于神经元的胞外分泌和动力学研究。实验检测到突触内部所释放的神经递质远比突触外部复杂。电化学还可用于检测单个囊泡释放的儿茶酚胺、5-羟色胺、胰岛素等物质[36,37]。目前,高分辨电化学成像得以快速发展。Katemann等[38]将扫描电化学显微镜与扫描离子电导显微镜相结合,实现对双功能探针的远程控制,对神经元细胞进行成像研究。但是,电化学检测的选择性和抗干扰性能依然有待提高,电极的长期稳定性和重复性也是需要解决的问题。

3 成像技术

光学成像是一种非接触式的分析技术,非常适合对单细胞进行连续、实时、无损监控[39]。

3.1 超分辨荧光显微成像

超分辨显微镜将生物学研究带入纳米时代,也加深了人们对微观世界的理解,如观察活细胞内生物大分子与细胞器微结构,以及细胞的动态变化,对于阐明细胞功能表达、理解生理过程和疾病病理具有重要意义。2008年庄小威研究组[40]发展了三维超分辨成像技术,横向分辨率可以达到20～30 nm,轴向分辨率可以达到50～60 nm,实验中成功观测到肾细胞的微管结构。2011年,该研究组[41]又利用此技术对活体大肠杆菌细胞的拟核相关蛋白质进行了跟踪观察,提出H-NS在染色体重组过程中所发挥的重要作用,并揭示细菌遗传物质的组织机制。2012年,该研究组[42]将此技术的横向分辨率减小至10 nm以下,轴向分辨率小于20 nm,获得了更加清晰的图像,进一步揭示了细胞骨架的超微结构。2015年,该研究组[43]结合了单分子成像和计算学方法,可以同时监测一个细胞中大约1 000种不同类型的RNA分子的分布情况。随着高分辨显微成像及相关技术的发展,使得研究者能够更加清晰地看到细胞内部各种动态变化,有益于各种微观生化反应的机理研究。在单细胞成像技术不断发展的过程中,如何做到无损成像也一直是科学家们在思考的问题。2016年Li等[44]创建了结构光照明显微技术。在高时空分辨的情况下,可将光源对细胞的伤害降到最低,并可对细胞进行“终身监控”。该技术采用超高数值孔径和内全反射技术,获得了84 nm以下的分辨率,可对细胞内吞和肌动蛋白细胞骨架的重构过程进行连续成像。随后又采用光控开关探针对网格蛋白质小窝实现45～62 nm的分辨率,用于描述激动蛋白和网格蛋白之间的相互作用,并阐明它在细胞内吞过程中所起的作用。随着超分辨显微镜价格的降低和性能的提高,此技术将会在单细胞形态观测和荧光成像检测方面发挥重要作用。但荧光探针和荧光标记技术的滞后限制了超分辨显微成像技术的快速发展,所以亟须发展出颜色丰富且对细胞毒性较小的荧光染料。此外,多种目标物同时检测也是一个重要的发展方向。

3.2 拉曼光谱成像

拉曼光谱可以对非荧光活性分子进行成像,具有选择性高、无需复杂的样品前处理等优势,是荧光显微成像的重要补充。其中,基于纳米探针的表面增强拉曼光谱具有单分子灵敏度,可追踪活细胞内物质组成、分布及其变化[45]。Syme等[46]将4-巯基苯甲酸与银粒子所组成的SERS纳米探针采用被动吸收的方式引入细胞,利用纳米探针在细胞内的运动轨迹可以对细胞的分裂过程进行追踪。是一种快捷、高效、无损、高灵敏度的检测手段。但是,由于探针的引入会改变细胞的状态,科学家也一直追求一种无需标记的成像技术,以期在细胞自然生长状态下对细胞进行研究。近年来相干拉曼散射技术不断发展,已可用于脂质存储、新陈代谢、细胞分裂和凋亡、轴突的髓鞘再生、药物细胞吞噬等方面的观测研究[47]。2011年,Fu等[48]将受激拉曼散射技术与傅里叶变换技术相结合,用于微藻细胞中油类、色素和蛋白质的同时检测,实现了多种物质的非标记快速定量研究。随后,Zhang等[49]又将此技术用于单个果蝇和哺乳动物细胞中核酸、脂质、蛋白质以及细胞分裂时期DNA缩合过程的成像分析。但是,目前的各种拉曼光谱成像技术的检测下限还比较高,只能观测数千个以上聚集成团的同类分子簇。

4 总结

本文只对几种代表性的单细胞分析技术进行综述。但我们并不能忽视其他技术在单细胞分析方面所做的贡献,如单细胞测序技术使得单细胞基因分析成为可能[50]、流式细胞术极大地提高了单细胞检测的分析通量。成像技术可在不破坏细胞的前提下,快速、连续的监测细胞的动态变化。另外,单细胞成像分析与单细胞分离检测是互补关系,前者研究可标记分子在细胞内的分布和细胞的形态,后者则研究细胞内特定区域里所含分子的种类和数量。因此,进一步提高单细胞的在线样品处理能力、无损失分离能力和超高灵敏度检测能力是单细胞分离检测技术的发展方向。

[1] Sun L L, Dubiak K M, Peuchen E H, et al. Anal Chem, 2016, 88: 6653

[2] Kleparnik K, Foret F. Anal Chim Acta, 2013, 800: 12

[3] Jorgenson J W, Kennedy R T, Stclaire R L, et al. Res Natl Bur Stand, 1988, 93(3): 403

[4] Hsieh S, Jorgenson J W. Anal Chem, 1997, 69: 3907

[5] Yu J, Li C Y, Shen S J, et al. Rapid Commun Mass Spectrom, 2015, 29: 681

[6] Cha S, Imielinski M B, Rejtar T E, et al. Mol Cell Proteomics, 2010, 9: 2529

[7] Wallingford R A, Ewing A G. Anal Chem, 1988, 60: 1972

[8] Gilman S D, Ewing A G. Anal Chem, 1995, 67: 58

[9] Wightman R M, Finnegan J M, Pihel K. Anal Chem, 1995, 14: 154

[10] Nemes P, Knolhoff A M, Rubakhin S S, et al. Anal Chem, 2011, 83: 6810

[11] Nemes P, Rubakhin S S, Aerts J T, et al. Nat Protoc, 2013, 8: 783

[12] Liu J X, Aerts J T, Rubakhin S S, et al. Analyst, 2014, 139: 5835

[13] Sobhani K, Fink S L, Cookson B T, et al. Electrophoresis, 2007, 28: 2308

[14] Kleparnik K, Horky M. Electrophoresis, 2003, 24: 3778

[15] Mellors J S, Jorabchi K, Smith L M, et al. Anal Chem, 2010, 82: 967

[16] Huang B, Wu H K, Bhaya D, et al. Science, 2007, 315(5): 81

[17] Marc P J, Sims C E, Bachman M, et al. Lab Chip, 2008, 8: 710

[18] Xu X, Thompson L V, Navratil M, et al. Anal Chem, 2010, 82: 4570

[19] Dickinson A J, Armistead P M, Allbritton N L. Anal Chem, 2013, 85: 4797

[20] Cohen D, Dickerson J A, Whitmore C D, et al. Annu Rev Anal Chem, 2008, 1: 165

[21] Deng B, Wang Z M, Song J, et al. Anal Bioanal Chem, 2011, 401(7): 2143

[22] Yang Q, Zhang X L, Bao X H. J Chromatogr A, 2008, 1201: 120

[23] Wang K L, Jiang D C, Sims C E. J Chromatogr B, 2012, 907: 79

[24] Zhang H, Jin W. J Chroinatogr A, 2006, 1104(1): 346

[25] Mascini N E, Heeren R M A. TrAC-Trends Anal Chem, 2012, 40: 28

[26] Boggio K J, Obasuyi E, Sugino K, et al. Expert Rev Proteomic, 2011, 8(5): 591

[27] Zavalin A, Todd E M, Rawhouser P D, et al. Mass Spectrom, 2012, 47: 1473

[28] Kulp K S, Berman E S F, Knize M G, et al. Anal Chem, 2006, 78: 3651

[29] Piehowski P D, Carado A J, Kurczy M E, et al. Anal Chem, 2008, 80: 8662

[30] Steinhauser M L, Bailey A P, Senyo S E, et al. Nature, 2012, 481: 516

[31] Gao N, Wang W L, Zhang X L, et al. Anal Chem, 2006, 78(9): 3213

[32] Zhang L, Qv S, Wang Z, et al. Analyt Technol Biomed Life Sci, 2003, 792(2): 381

[33] Paolo A, Sergiy T, Jan C. ACS Nanovol, 2014, 8(1): 875

[34] Li X, Majdi S, Dunevall J, et al. Angew Chem, 2015, 54: 11978

[35] Li Y T, Zhang S H, Wang L, et al. Angew Chem, 2014, 53: 12456

[36] Zhou Z, Misler S. Proc Natl Acad Sci, 1995, 92: 6938

[37] Huang L, Shen H, Atkinson M, et al. Proc Natl Acad Sci, 1995, 92: 9608

[38] Ballesteros K B, Schulte A, Schuhmann W. Electroanalysis, 2004, 16: 60

[39] Gustafsson M G L, Agard D A, Sedat J W. Microsc, 1999, 195(1): 10

[40] Huang B, Wang W Q, Bates M, et al. Science, 2008, 319: 810

[41] Wang W Q, Li G W, Chen C Y, et al. Science, 2011, 6048(333): 1445

[42] Xu K, Babcock H P, Zhuang X W. Nat Methods, 2012, 9: 185

[43] Chen K H, Boettiger A N, Moffitt J R, et al. Science, 2015, 348: 6233

[44] Li D, Shao L, Chen B C, et al. Science, 2015, 349: 6251

[45] Nan X, Tonary A M, Stolow A, et al. Chem Bio Chem, 2006, 7: 1895

[46] Syme C D, SirimuthuI N M, Faley S L, et al. Chem Commun, 2010, 46(42): 921

[47] Konorov S O, Glover C H, Piret J M, et al. Anal Chem, 2007, 79: 7221

[48] Fu D, Lu F K, Zhang X J. Am Chem Soc, 2012, 134: 3623

[49] Zhang X, Roeffaers M B J, Basu S, et al. Chem Phys Chem, 2012, 13: 1054

[50] Wen L, Tang F C. Genome Biology, 2016, 17: 71

Latest developments of single cell analysis

SHI Meng1,2, SONG Zhihua1,2, GENG Xuhui1, WU Dapeng1, GUAN Yafeng1*
(1.KeyLaboratoryofSeparationScienceforAnalyticalChemistry,DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China; 2.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)

Single cell analysis can reveal the cellular components and physiological behavior diversity. It is on the cutting-edge of bio-analytical chemistry. Challenges on detection limit, resolution, and precise manipulation of cells are really tougher than ever before. This review includes the developments of several main techniques about separation, detection and imaging. At last, the future developments in separation and detection are discussed.

single-cell; separation; detection; imaging; review

10.3724/SP.J.1123.2016.08039

2016-08-31

国家自然科学基金项目(21405157);中国科学院重点部署项目(KFZD-SW-203,SW-203-03).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21405157); Key Program of the Chinese Academy of Sciences (Nos. KFZD-SW-203, SW-203-03).

O658

:A

:1000-8713(2017)01-0105-05

*通讯联系人.Tel:(0411)84379590,E-mail:guanyafeng@dicp.ac.cn.