细胞检测技术的研究进展

高小丽

(重庆化工职业学院，重庆 401228)

细胞检测技术的研究进展

高小丽

(重庆化工职业学院，重庆 401228)

随着细胞生物学的发展，细胞的检测技术和方法不断涌现，本文对目前常见细胞检测技术和方法的原理、特点及应用作一个较全面的综述。

细胞；检测技术；应用

细胞的研究已成为生命科学研究的核心内容，因此，与此相应的细胞检测技术也越来越受到人们重视，本文将对目前常见的几种细胞检测技术和方法做一概述。

1 显微镜技术

20世纪六十年代以来，显微技术逐渐成为了研究细胞一个主要工具，它实现了从亚显微层次甚至分子层次去研究细胞的聚集、排斥以及黏附行为，细胞的连接阻断，细胞的免疫识别，细胞的融合以及细胞与其他物质(如酶作用物、药物、化合物、小分子等)的相互作用等等。接下来，本文将重点介绍几种荧光和电子显微镜技术及一些化学、物理细胞检测技术。

1.1 荧光显微检测技术

荧光显微技术是利用紫外线照射物质，使之发出荧光，然后再在显微镜下观察物体形状或位置的一种方法，它既可以检测细胞中某些本身可以发荧光的物质，也可以检测本身不能发荧光但用荧光染料或荧光抗体染色后，可以发荧光的物质。如李勤[1]等人利用荧光显微镜对As2O3诱导MGC-803细胞核凋亡过程中的钙振荡进行研究。

后来，荧光蛋白新型标记物的出现了，荧光显微镜得到了长足的发展，一系列新型的荧光显微检测技术应运而生，如荧光斑点显微镜(FSM) ，荧光寿命成像显微镜(FLIM)以及基于荧光寿命测量的荧光共振能量转移显微镜(FRETM)和全内反射荧光显微镜(TIRFM)等，这些技术广泛应用于转基因动物的研究、蛋白在活细胞内功能定位及迁移变化、基因治疗、融合标记，病原菌侵入活细胞的分子过程，单分子检测(如细胞内受体)，胞外分泌或细胞内吞作用的成像，细胞与基层的相互作用的形貌，进行蛋白质动力学研究，膜离子通道研究以及相关膜的光敏剂研究，为实现在分子水平上进行细胞研究作出了巨大的贡献。

荧光显微检测技术作为生物物理、生物化学及临床医学研究的重要工具已有很大的进展，在与先进方法融合后，减少了背景荧光，增加了信号分辨率，解决了由于非均匀荧光标记所造成的不能进行的荧光结构的动态监测的难题，但仍然由于紫外线光源杀伤力问题，在对极微弱荧光的使用时间方面受到限制。

1.2 激光共聚焦扫描显微镜

激光共聚焦扫描显微镜[2](LCSM)是在荧光显微镜成象的基础上，利用激光扫描和共聚焦光路获得样品的显微图像，可对活细胞结构、分子、离子进行动态监测。目前，激光共聚焦扫描显微镜已在形态学、分子细胞生物学、遗传学、环境科学、生物化学、植物学、食品学、病理学领域得到广泛应用，可对细胞内钙离子和pH值进行动态分析，可进行细胞间通讯研究和长时程观察细胞的迁移和生长，可进行组织和细胞的定量荧光和物理化学测定等[3-5]。

激光扫描共聚焦显微镜是一项全新的实验手段和强有力的研究工具，较传统显微镜，有着不可比拟的优势，如图像高反差、高清晰度、定位准确，具有三维空间分辨能力，能够同时获得多重荧光和光镜图像，定量测定荧光信号的强度、面积、距离等指标。近年出现的视频型共聚焦激光显微镜、4Pi共聚焦激光显微镜以及多光子共聚焦激光显微镜[6]，它们与传统LCSM比较，更能解决生物组织中深层物质的层析成像问题，能进一步减少荧光背景的干扰，可以对活细胞进行更长时间的观察。激光共聚焦显微镜已经成为亚细胞层次研究细胞相互作用的强有力研究工具之一。

1.3 电子显微技术

电子显微镜是人类迄今为止进行细胞亚微结构观察中最用力的工具。在光学显微镜下无法看清小于0.2nm的显微结构或超微结构，电子显微镜能看清这些结构。它是用高速电子束代替了照明光线，当电子束照射样品时，由于样品不同部位对入射电子具有不同散射度，而形成不同的电子密度的高度放大图像，最后显示在荧光屏上或记录在照相感光胶片上，经过不断的改进，目前电子显微镜的分辨率最高可达0.08 nm，实现了原子尺度上观察物质结构的理想。

目前透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)[7]以及80年代以后出现的扫面透射电子显微镜在生物学领域通常是被用于研究细胞内部的细微、超细微结构，提供立体的、原子级、分子级、单细胞级分辨率的图像和表面拓扑信息，以及形态分析、毒理分析、药物作用靶点分析和细胞微结构分析等重要的有用信息[8]。蒋争凡等人[9]在透射电子显微镜和扫描电子显微镜下观察到经细胞色素C诱导的小鼠肝细胞细胞核的凋亡形态-染色质的凝集及趋边化。

电子显微镜的分辨率虽然比起光学显微镜有了显著的提高，但电子显微镜必须在真空的条件下进行观察，对生物大分子还须进行梯度脱水、染色、临界点干燥、喷涂导体物质等前处理工作，故无法实现在接近天然条件和生理条件下实时地、原位地、现场地研究生物样品的单原子、单分子和单细胞成像。

1.4 扫描探针显微镜技术

扫描探针显微技术[10]是用来探索表面性质的仪器家族，其测量的特征尺寸可以从原子间距到100μm之间变化，至1986以后，相继出现了很多新型扫描探针显微镜，主要有原子力显微镜(/AFM) 光子扫描隧道显微镜(STP),扫描离子电导显微镜(STCM)等,以原子力显微镜(AFM)为代表的SFM，它的工作原理是利用一个对力非常敏感的微量臂和探针，与样品表面接触，产生极其微弱的作用力，使微量臂变形，通过捕捉这个形变信号，来而获得物质的表面形貌结构信息的一种方法。AFM因其纳米级的空间分辨率、超高灵敏度和免标记以及可在溶液下工作等独特优势， AFM成为细胞生物学的重要研究手段，过去的数十年中，研究人员利用AFM在细胞超微形貌成像和机械特性测量方面开展了广泛的应用研究，可以对活体细胞、细菌、细胞中肌动蛋白的动态过程，细胞膜的精细结构等进行观察研究[11]。

2 常用的生物学方法

2.1 MTT法

MTT-四甲基偶氮唑盐比色法，是90年代发展起来的一种测定细胞相对活力和细胞相对数的生物学方法，其原理是细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶可以使外援性的MTT还原为难溶性FTT甲，一种蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而死亡的细胞无此功能，经酶标仪或分光光度计以570 nm比色，测定各孔的吸光度值A，它在一定程度上反映了细胞的生存能力，并可以检测出OD值与细胞增值数目呈直线关系。这种方法重复性好，简单易行，已被研究者们作为一种辅助方法广泛地应用于细胞、药物、大分子甚至物理辐射等物质与细胞相互作用后的细胞存活率和细胞增值情况。但如要进行验证或深入研究还需要辅助其他的方法。

2.2 流式细胞技术

流式细胞技术(FCM)[12]是当代最先进的细胞定量分析技术，在液流中，处理过的细胞逐个通过聚集的光源，进而快速测量这些细胞的光散射、荧光和光吸收等信号而达到测定细胞的化学性质、物理性质和生物学特性的目的。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，在医学和生物学领域有着广泛应用。陈阳等人[13]以罗丹明123作为荧光指示剂，利用耐药HR-20活细胞筛选逆转耐药性的药物, 建立了一种精确度较高、稳定性较好、有效的高通量药物筛选方法。

3 其他方法

3.1 毛细管电泳法

毛细管电泳(CE)是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离检测技术，因其样品用量少、分析速度快的特点，广泛应用于单细胞内多种组分的分离和测定。Ewing，Jorgenson 和Sweedler 研究组开创性地将毛细管电泳用于非哺乳动物神经细胞分析。Frederic 等用CE-LIF测量鼠脑中儿茶酚胺和氨基酸的含量。

3.2 细胞传感器法

细胞传感器技术[32]利用活细胞作为研究对象，使之与电极或其他信号元件结合，定性定量地检测细胞的基本功能信息。它可以监测单个活细胞的生理功能，也可以通过捕捉细胞代谢产生的电子转化成电信号来确定细胞浓度大小，如在芯片上通过培养吸收了已知cDNA，利用生物芯片探针杂交检测原理，便可检测激动剂或抑制剂对细胞内部的基因表达的影响。

4 展望

目前，可用于细胞以及细胞相互作用分析高灵敏分析检测方法已有许多，应用领域不断扩大。但是实时、在线、原位、活体分析细胞技术还有待进一步发展和研究，实现细胞的分析要建立在未受任何外界条件影响的情况下的真实有效的分析。此外，结合多个学科，研制新型分析仪器，发展各种检测技术的联用，实现在分子水平上研究细胞内的各种化学反应如蛋白-蛋白、核酸-核酸反应等，让人类从细胞水平、分子水平上研究生命活动的本质，从而为生命科学提供更好和更多的有用信息。

[1] 李 勤,马 瑜，俞 信，等.数字化高灵敏度荧光显微镜在As2O3诱导MGC-803细胞核凋亡产生钙振荡研究中的应用[J].生命科学仪器，2004，2(3)：18-21.

[2] EGGER M D. The development of confocal microscopy[J].TINS,1989, l2: 11.

[3] 李 叶,黄华平,林培群.激光扫描共聚焦显微镜[J].实验室研究与探索,2015,34(7):262-265.

[4] 杨子贤,王洪星,易小平.激光扫描共聚焦显微镜在生物科学研究中的应用[J].热带生物学报,2013,4(1):99-104.

[5] 郭喆霏,成晓岚,罗宇燕,等.激光共聚焦显微镜分析载蛋白微球的结构及药物分布[J].中国医院药学杂志,2015,35(15):1381-1384.

[6] 许险峰,徐锡金,霍 霞.共聚焦激光扫描显微镜技术[J].激光生物学报,2003,12(2):156-160.

[7] Li Maohua,Yang Yanqing,Bin Huang. State Key Laboratory of Solidification Processing, Northwestern Polytechnical University;Beijing Institute of Aeronautical Materials[J].Transactions of Nonferrous Metals Society of China,2014(10):45-48.

[8] 杨志远,杨水金. 扫描电子显微镜在无机材料表征中的应用[J].湖北师范学院学报:自然科学版,2015,35(4):56-63.

[9] 蒋争凡,卞 婕,翟中和.非细胞体系诱导小鼠肝细胞核凋亡的超微观察[J].电子显微学报,1998(4):22-27.

[10] 赵清亮,王景贺,李 旦，等.扫描探针显微镜的最新技术进展及应用[J].传感技术学报,1999,12(4):321-326.

[11] 梁 艳,李 晨, Mariska,等. 单个腺病毒颗粒的原子力显微镜液相成像及样品制备方法[J].病毒学报,2015,31(6):601-606.

[12] 周 丽,周振英. 流式细胞仪研制的技术进展[J].现代医学仪器与应用.2003,15(1):11-17.

[13] 陈 阳,徐 榕， 司书毅 ，等. 流式细胞仪高通量药物筛选技术的建立和应用[J].齐鲁药事,2011,30(1):1-2.

(本文文献格式：高小丽.细胞检测技术的研究进展[J].山东化工，2017，46(10)：87-88，91.)

The Research Progress of Cell Detection Technology

GaoXiaoli

(Chongqing Chemical Industry Vocational College,400020,China)

With the development of cell Biology, it appears that more and more techniques and methods are applied to studying cells. The main principles, characteristics and application of these techniques and methods are roundly reviewed in this paper.

cell;techniques and methods;application

2017-03-31

高小丽(1979—)，女，四川乐山人，讲师，硕士，从事生物传感器研究。

Q939.4

A

1008-021X(2017)10-0087-02