关于埃博拉病毒核酸检测试剂应急审评的探讨

何静云

国家食品药品监督管理总局 医疗器械技术审评中心，北京 100044

关于埃博拉病毒核酸检测试剂应急审评的探讨

何静云

国家食品药品监督管理总局 医疗器械技术审评中心，北京 100044

2014年埃博拉病毒出血热疫情引起了全世界的关注，为做好疫情监控，严防疫情输入，药监总局启动埃博拉病毒检测试剂应急审批程序，推动应急用体外诊断试剂产品尽快完成审批。本文就埃博拉病毒核酸检测试剂应急审评要求及审批条件进行解析和介绍，并结合此次应急审批工作提出了对应急审评的思考。

体外诊断试剂；埃博拉病毒；应急审批

2014年初，埃博拉出血热疫情在非洲暴发，并呈现迅速蔓延的趋势。这是自埃博拉病毒发现以来最严重的一次疫情。世界卫生组织于2014年8月8日宣布这次疫情为“国际突发公共卫生事件”[1]，并呼吁国际社会提供紧急支援，来自中国、美国、加拿大、澳大利亚等国家的医护救援人员、移动实验室等先后抵达疫区。在史无前例的国际社会援助和疫区国家的努力下，疫情在2015年初得到控制。

1 埃博拉病毒核酸检测试剂应急审批程序启动的必要性

埃博拉病毒自1976年首次被发现以来，已暴发过20余次，2014年的暴发甚于以往任何一次，并已突破了美国防线，美国本土出现了9例埃博拉病患，其中1人死亡。我国与非洲国家在劳务、商务、留学教育等领域都有较为密切的来往，疫情的输入风险较大。美国东北大学生物和社会-技术体系建模实验室（MOB LAB）做了预测，对可能出现输入性埃博拉病例的前30个国家进行排名,中国排名第16位[2]。

2014年，为做好国内的应对准备，严防疫情输入，同时对非洲国家提供有效的医疗救援和支持，中国政府启动了由卫计委、科技部、检验检疫总局、药监总局等多部门参与的联防联控机制；同时，国家食品药品监督管理总局亦启动了埃博拉诊断试剂的应急审批程序，为已有相关工作基础和技术储备、可为埃博拉病毒核酸检测试剂的研制和生产做出快速响应的体外诊断试剂企业开辟应急审批通道；同时由总局医疗器械技术审评中心建立相关技术审评方案，并以此为依据，指导埃博拉病毒核酸检测试剂的开发和注册申报，完成技术审评，推动埃博拉病毒检测试剂的研制和生产，促进埃博拉出血热疫情应急储备用核酸检测试剂的早日上市，为疫情防控提供有效的应急储备。

作为国家药监总局医疗器械技术审评中心审评员，笔者参与了此次埃博拉病毒核酸检测试剂应急审批工作，包括应急审评方案的建立和相关产品的技术审评。下面就相关应急审评方案的内容和应急储备产品审批条件进行解析和介绍，并结合此次应急审批工作进行讨论。

2 埃博拉病毒核酸检测试剂

埃博拉病毒是埃博拉出血热的病原体,属于丝状病毒科埃博拉病毒属，为有包膜、不分节段的单股负链RNA病毒。2014年西非疫情是由致病性最强的埃博拉病毒扎伊尔型引起的。由于尚没有针对性的埃博拉疫苗和治疗方案，埃博拉病毒被归入生物安全第4级病毒。埃博拉病毒致病性强，感染后病死率高，鉴于尚无预防疫苗和有效的治疗手段，及时的实验室诊断是控制传染源、避免疫情扩散的重要手段[3]。同时，埃博拉出血热的早期临床表现和其他一些病毒性出血热相似，因此实验室检测更是鉴别诊断的重要手段。实验室病原学检测的主要方法有病毒分离、病毒核酸检测和抗原检测等[4-5]。

目前，荧光探针PCR法检测病毒核酸是病毒感染急性期实验室诊断最重要的方法之一。该技术在PCR反应体系中加入特异性引物和探针，探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板特异性结合，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，如样本中存在待测靶序列，则PCR扩增时可监测到荧光信号，荧光信号的累积与PCR模板量呈正相关。

埃博拉病毒基因组编码7个结构蛋白和2个非结构蛋白，基因顺序为3'-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5'。NP为核衣壳蛋白，是重要的结构蛋白；GP是跨膜糖蛋白，与病毒的入侵和细胞毒性有关；L为RNA依赖的RNA聚合酶，是病毒基因组复制必需的酶[6]。在埃博拉病毒核酸检测试剂中，大多以NP和/或GP基因为检测靶标，部分产品将L基因设为内参基因。

3 埃博拉病毒核酸检测试剂应急审评方案

3.1 应急审评方案重点解决的问题

体外诊断试剂的研制、评价、生产及产品注册等，首先应符合《体外诊断试剂注册管理办法》[7]及其配套文件和指导原则的要求。但埃博拉病毒核酸检测试剂开发和注册申请尚无法完全满足上述基本要求，主要难点在于缺少有效的参比系统。一般地，新的病毒核酸检测试剂应以病毒分离培养为参比系统，评价检测试剂的分析灵敏度和特异性，并在临床试验中以临床诊断金标准为参比系统，采用相关病毒感染者样本及阴性样本评价试剂临床性能。例如，以往的甲型H1N1（2009）流感病毒、手足口病以及人感染H7N9禽流感病毒检测试剂，作为新的病毒检测试剂，在应急审评中，均要求采用病毒培养物进行实验室性能评价，并采用充分数量的阳性病例，对试剂的阳性检出能力进行充分评价[8]。而本次应急储备急需的埃博拉病毒核酸检测试剂却不具备如上条件。一方面，埃博拉病毒为生物安全等级4级病原体，目前在我国尚不具备体外培养的条件，无法获得培养病毒或灭活病毒；另一方面，此次疫情主要发生在非洲，境内尚无感染的阳性病例，无法采用病毒感染阳性样本进行阳性检出能力评价。

可见对于埃博拉病毒核酸检测试剂的临床前研究和临床试验均不能按照一般的新的病毒核酸检测试剂同样要求。关于埃博拉病毒核酸检测试剂应急储备产品的审评方案需要重点解决的问题在于，在缺乏病毒培养物和临床阳性样本的情况下，设定分析性能评价和临床性能评价要求，在现有条件下尽可能充分评估或预判被考核产品对于埃博拉感染者样本中真实目标物的阳性检出能力。涉及体外诊断试剂的其他审评要求，如原材料研究、生产工艺及反应体系研究、稳定性研究等方面则可借鉴已有的相关法规、文件和指导原则。

3.2 应急审评方案解析

埃博拉病毒核酸检测试剂应急审评方案的建立，旨在为相关应急储备体外诊断试剂的申报提供指导，为技术审评提供依据，促进埃博拉病毒实验室检验方法的建立，为2014西非埃博拉出血热疫情的防控提供诊断试剂储备。虽然疫情防控的形势十分紧迫，且此类产品的评价面临如上所述的诸多困难，但鉴于其临床意义重大，仍不能随意降低技术审评标准，或减少审批程序。为保证应急审评方案的科学、合理和可操作性，我们多次征求相关企业的意见，并就技术指标的设定向病毒学、流行病学、临床检验学等方面的专家进行咨询，在充分考虑埃博拉病毒的特点，并结合体外诊断试剂注册管理法规要求的前提下，最终形成《在紧急情况下埃博拉病毒核酸检测试剂评价和临床试验要求》。下面就该方案中的具体要求进行详细分析和讨论。

根据已有体外诊断试剂相关法规、规章、规范性文件及指导原则要求，对于新的病毒核酸检测试剂，性能评估及临床试验基本要求包括：核酸提取/纯化性能、最低检测限、阳性检出能力、分析特异性、精密度、企业参考品、临床灵敏度、临床特异性等。

3.2.1 核酸（RNA）提取/纯化性能 此项分析性能要求与其他病原体核酸检测试剂的要求一致，即在进行靶核酸检测前，应设置适当的核酸（RNA）提取/纯化步骤。企业可选择在病毒核酸检测试剂中配置核酸提取/纯化组分，亦可选择已上市核酸提取/纯化试剂作为指定配套使用产品。无论哪种情况，企业都应结合检测试剂的特性，对配合使用的核酸提取组分/试剂的提取效率、提取核酸纯度等做充分的验证。应当注意的是，这里的“验证”应结合本检测试剂的特性进行评价，重点评价该提取/纯化方法是否满足本试剂的要求。

3.2.2 最低检测限 鉴于无法获得埃博拉病毒培养物或灭活培养物，有关检测限和阳性检出能力的评价只能采用模拟样本。为尽量模拟实际的病毒核酸提取和检测情况，我们建议生产企业采用包装目的基因的假病毒颗粒进行检测限等性能评价。若检测的靶物质包含多种埃博拉病毒型别，则在最低检测限的评价中，要求针对试剂适用的埃博拉病毒所有型别分别进行。此外，要求在样品基质方面应尽量与适用样本类型一致，且假病毒应做准确的浓度滴定。试验方法可将含有埃博拉病毒目的RNA片段的假病毒颗粒梯度稀释于（与适用样本一致的）适当基质中，每个浓度梯度最少重复3次检测，以100%可检出的最低浓度水平作为估计检测限，在此浓度附近制备若干梯度浓度样品，每个浓度至少重复20次检测，将具有90%～95%阳性检出率的最低浓度水平作为确定的最低检测限。

3.2.3 埃博拉病毒RNA阳性检出能力验证 在最低检测限的研究中已对产品的埃博拉病毒核酸检测能力进行了初步评价，但评价的样本仅限于假病毒。由于假病毒可包装的序列长度有限，根据生产企业的反馈，一般仅能包装PCR扩增序列，此样本的检测不能很好地代表试剂对病毒核酸的检测能力，亦不能考察不同病毒株可能对试剂检测能力产生的干扰。因此，在埃博拉病毒RNA阳性检出能力的评价中，要求采用埃博拉病毒检测目的基因的体外转录全长RNA进行检出能力验证，如NP、GP基因体外转录全长RNA；针对预期用途包含的每种埃博拉病毒型别，均应选择NCBI上已登录毒株中至少2个不同病毒株的基因序列分别完成此项验证。在专家咨询会中，专家对此项要求的提出亦比较认同，认为可以在缺乏真实病原体的情况下对诊断试剂的阳性检出能力进行进一步的把握和控制。

3.2.4 分析特异性 病毒核酸检测试剂的分析特异性主要包括其他病原体的交叉反应情况和内源及外源物质的干扰试验。

埃博拉病毒属于高致病性病原体，生物安全等级为4级，受试者样本检测出现假阴性或假阳性都将造成严重的后果。因此，在交叉反应方面须做充分的验证和评价。首先，交叉反应验证的病原体种类一般从两方面考虑：其一，须考虑可能存在基因序列同源性的病原体，如近缘微生物（其他型别埃博拉病毒、马尔堡病毒）等，以考察试剂是否有非特异扩增；其二，须考虑可引起相似症状或可在适用样本中共存的其他微生物，特别是本次疫情主要分布于非洲，须特别关注非洲常见病原体，以评价产品的鉴别诊断能力。其次，须考虑核酸提取中不可避免的人基因组DNA的干扰情况。

3.2.5 精密度 测量精密度的试验方法可以参考相关的CLSI-EP文件或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。企业应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求，如标准差或变异系数的范围等。精密度评价中应考虑检测试剂本身以及其他要素可能造成的精密度波动，包括PCR分析仪、操作者、地点等要素；应设定合理的精密度评价周期，从而对批内/批间、日内/日间精密度进行综合评价；用于精密度评价的质控品应至少包括3个水平（阴性、临界阳性和中、强阳性），可采用包含目的RNA的假病毒，基质应与适用样本类型一致。

3.2.6 临床研究 按照《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》的要求，针对新的病毒核酸检测试剂应在相应的临床环境中完成总例数不少于1000例的临床试验，入组样本应符合产品预期用途要求，并包括阳性样本和阴性样本，对试剂的临床性能进行系统性研究。但鉴于目前国内尚未有埃博拉病毒感染的阳性病例，允许采用符合要求的模拟阳性样本完成相关评价，因此该临床试验只能称为“模拟临床试验”，而非真正意义上的“临床试验”。但对于临床特异性验证所需的阴性样本，应当为有病原体感染症状的患者样本及留观人员样本，建议考虑有发热、腹泻、出血热等症状的患者，同时还应包括其他病毒感染或细菌血症患者的样本，特别应包含出血热病毒感染患者样本。这样，模拟临床试验中临床特异性的评价能够达到一般体外诊断试剂的要求。

此外，我们要求生产企业收集非洲疫区受试者样本与对照方法（建议使用WHO认可的同类检测试剂，如无法获得，可采用其他国际权威组织认可的同类检测试剂）进行对比试验。鉴于此项工作开展的难度较大，建议埃博拉病毒核酸阳性样本不少于200例，总样本不少于300例。此项工作在科技部的协调下最终由援非医疗队协助完成。

通过非洲临床样本，特别是埃博拉病毒感染者样本的临床试验，被评价产品的阳性检出能力得到了较好的验证，为产品临床有效性的评价提供了保障。

3.3 埃博拉检测试剂应急产品的条件审批

在埃博拉病毒核酸检测试剂评价方案的指导下，我们于2014年底到2015年初先后完成了5项埃博拉病毒核酸检测试剂的技术审评。但鉴于这些产品尚不能满足《体外诊断试剂注册管理办法》等相关法规的要求，因此不能按照常规体外诊断试剂予以批准，仅批准其用作2014埃博拉病毒性出血热疫情的应急储备，并对这些产品的应用提出如下限制：仅作为应对2014年暴发于西非的埃博拉病毒出血热疫情的体外诊断应急储备，不能作为常规体外诊断试剂应用于临床；在使用上应当遵守卫计委发布的“埃博拉出血热防控方案”及相关实验室检测的要求；试剂适用人群应符合“埃博拉出血热防控方案”的要求，包括2014年埃博拉出血热疫区有疑似症状人群或有埃博拉病毒接触或暴露风险的人群等。同时，应急储备批准的有效期限按照疫情的持续情况，设定为6个月，并明确说明如需再次启动本产品的应急储备，企业应重新申请；用于常规临床诊断则应按照《办法》另行注册；并要求待中检院应急参考品正式发布后，上述申请人应提交3批检验报告。

应急审批完成后6个月左右，我们就埃博拉应急储备产品的生产和临床应用情况进行了调研，部分产品分别有数千至上万人份销售量，主要应用于非洲疫区国家、国内各级疾病预防控制中心和出入境检验检疫局等。为疫区埃博拉病毒出血热疫情的控制提供了支持，亦为我国境内疫情防控提供了保障。其中一项产品还受到WHO认可，并被批准列入WHO官方采购目录。

在本次国家药监总局埃博拉检测试剂应急审批任务的执行过程中，面对现有产品缺乏有效的阳性参照系统，尚不能完全符合相关产品注册申报要求，但出于疫情防控需要，急需诊断试剂储备的现实，我们在充分调研和讨论的基础上建立了技术审评方案，一方面充分论证产品的检测特异性，最大程度避免假阳性反应；另一方面借助国家疫情联防联控机制的支持，将被考核试剂应用于非洲疫情阳性样本的检测，以评价其真实的阳性检出能力，在现有条件下尽可能保证产品的检测灵敏度。

值得一提的是，美国FDA于2014年8月发布了一项获得紧急情况应用授权（Emergency Use Authorization，EUA）的扎伊尔型埃博拉病毒核酸检测试剂[9]，由于美国具备BSL-4实验室条件和体外培养的埃博拉病毒株，因此对试剂的评价采用了灭活的埃博拉病毒株进行，但未能采用埃博拉病毒感染的临床阳性样本进行临床性能评估。与我国同类产品审批情况相同的是，两者虽然都在一定程度上验证了试剂的阳性检出能力，但均不够充分，因此均未按照常规体外诊断试剂（IVD）产品予以批准。随后，美国FDA相继又批准了超过4项Ebola核酸检测试剂的紧急情况应用授权[9]。

4 有关应急储备产品审评审批的思考

此次埃博拉病毒核酸检测试剂应急审评的情况与以往历次突发公共卫生事件急需的体外诊断试剂的审评情况有很大不同。在甲型H1N1（2009）流感病毒、手足口病以及人感染H7N9禽流感病毒检测试剂的应急审评中，我国境内均有疫情发生，可以获得足够数量的阳性病例，对试剂的阳性检出能力进行充分评价。而埃博拉病毒核酸检测试剂的评价既缺少阳性样本又不能获得真实的病毒，大部分评价仅限于模拟样品，而这样的评价是无法满足《体外诊断试剂注册管理办法》的基本要求的。在这样的情形下，我们探索了新的审评审批方式，即，仅以疫情防控用应急储备产品予以批准，而非常规体外诊断试剂，并在注册证有效期及产品适用范围上予以严格限定。这样，既保证了疫情防控的应急储备需要，又实现了审评审批的客观和科学，亦为以后的新发、高致病性病原体相关检测试剂的审评审批工作提供了借鉴和经验。

如上文所述，美国FDA批准的扎伊尔型埃博拉病毒核酸检测试剂，是采用了“紧急情况应用授权”的方式，而不是常规体外诊断试剂批准的510（k）或PMA形式。主要原因也在于因缺少确诊的阳性病例，无法按正常程序对产品的检测性能和临床性能进行完整充分的评价，仅可采用EUA的审批要求对申报产品进行审评；同时在批准紧急情况应用授权的同时，对产品的使用进行严格限制，如该产品只能在紧急情况下使用，并且只能在美国国防部认可并指定的实验室中使用，检测人群为来自疫区并且有相应感染症状或暴露于流行病学危险因素下的人群，获得此项授权的申请人必须将此授权通知指定的实验室和相关的公共健康机构等。同时FDA有相关规定，FDA将在疫情结束后终止授权产品的使用，并建议申请人在条件允许及产品研制符合要求后再根据正常程序进行产品申报[10]。

综上，本次埃博拉病毒核酸检测应急储备产品的审批方式与上述FDA的EUA批准模式较为类似，包括产品应用范围的限制、批准/授权期限的限制等。但在美国，EUA是FDA的一条专门的审批途径，具有配套的流程和审批标准；而此次我国相关产品的审批仍采用了常规IVD产品的审批途径，有关“疫情应急储备用产品”的条件审批限制，仅以注册证备注形式提出，其执行有赖于审批部门和相关注册人的充分沟通，在某种程度上缺少制度上的规范和保障。2015年MERS疫情暴发后，相关应急审评工作也面临同样的问题。可见在如今的流行病形势下，这样的情况再次发生的可能性很大，笔者认为国家药监总局有必要考虑应急审批途径的建立，以实现相关产品批准的规范化和制度化。

[1]WHO Statement on the Meeting of the International Health Regulations Emergency Committee Regarding the 2014 Ebola Outbreak in WestAfrica[EB/OL].http://www.who.int/medicacentre.[2014-08-08]

[2]最可能出现输入性埃博拉病例的30个国家，中国第 16位[EB/OL].http://www.biodiscover.com/news/poli-tics/113724.html.[2014-10-17]

[3]张应涛,刘康康,陆家海.2014年西非埃博拉出血热流行状况与防控研究[J].暨南大学学报（自然科学与医学版）,2014,35(5):421-426.

[4]高伟,赵平,任浩,等.埃博拉病毒感染的实验室检测方法[J].微生物与感染,2014,9(4):202-209.

[5]郭雅玲,王超君.埃博拉出血热的防控策略及其研究进展[J].国外医学医学地理分册,2015,36(1): 5-8.

[6]程颖,刘军,李昱,等.埃博拉病毒病：病原学、致病机制、治疗与疫苗研究进展[J].科学通报,2014, 59(30):2889-2899.

[7]体外诊断试剂注册管理办法[Z].国家食品药品监督管理总局令第5号.2014-07-30.

[8]国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心.人感染H7N9禽流感病毒检测试剂审评要点[Z].2014-07-09.

[9]Emergency use authorization[EB/OL].http://www.fda.gov.[2017-01-18]

[10]Emergency use authorization of medical products and related authorities[EB/OL].http://www.fda.gov.[2017-01-18]

Discussion on the Emergency Use Evaluation for Ebola De⁃tection Kits

HE Jing-Yun*
Center of Medical Device Evaluation,CFDA,Beijing 100044,China
*Corresponding author,hejy@cmde.org.cn

The outbreak of Ebola hemorrhagic fever in 2014 had got a global attention.In order to monitor and prevent input of Ebola epidemic effectively,CFDA started the Review and Approval Procedure for Medical Device Registration under Emergency Situation for Ebola RNA detection kits to prompt the registration of the needed invitro diagnostics kit（IVD）products.The requirements and restrictive condition for the emergency use Ebola RNA detection kits are reviewed,and based on this project of conditional approval,the thinking about emergency evelua⁃tion is introduced.

in-vitro diagnostics kit;Ebola virus;emergency evaluation

R373;R197

A

1009-0002（2017）01-0023-06

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.01.005

2017-12-22

何静云（1978-），女，助理研究员

何静云，（E-mail）hejy@cmde.org.cn