肉苁蓉种子质量评价及药材初加工研究＊

谷彩梅，刘德旺，王增绘，蔡敏＊＊，黄林芳＊＊

（1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所北京100193；2.内蒙古医科大学药学院呼和浩特010080）

肉苁蓉种子质量评价及药材初加工研究＊

谷彩梅1，刘德旺2，王增绘1，蔡敏2＊＊，黄林芳1＊＊

（1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所北京100193；2.内蒙古医科大学药学院呼和浩特010080）

目的：对肉苁蓉种子质量进行评价并建立种子质量分级标准；考察不同初加工方法对肉苁蓉主要有效成分影响，确定肉苁蓉的适宜加工方法。方法：以种子千粒重、空胚率、水分含量等方面对肉苁蓉种子进行质量评价；分别对冷冻干燥法、自然烘干法和热风循环烘干法进行初加工方法考察，采用HPLC-UV法测定不同初加工方法下肉苁蓉中苯乙醇苷的含量。结果：建立肉苁蓉种子质量分级标准并根据评级指标将种子分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个等级；通过对加工方法的考察表明最优加工方法为冷冻干燥法，该方法有效成分损失少、饮片外形美观、质地酥脆、干燥速度快。结论：本研究结果为肉苁蓉种子资源的质量控制提供参考，也为肉苁蓉鲜品的初加工方法提供了科学依据。

肉苁蓉种子质量发芽率冷冻干燥法苯乙醇苷

肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.M，又称荒漠肉苁蓉，为列当科多年生全寄生植物，被誉为“沙漠人参”，是中国西北荒漠地区特有的名贵补益类中药材（图1）。始载于《神农本草经》，具有补肾阳、益精血、润肠通便等功效；用于阳痿、不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等症，为历代使用频度最高的补肾阳药物之一[1]。肉苁蓉属植物全世界约有20种，分布于欧亚温暖的干燥地区，从欧洲的伊比利亚半岛经非洲北部，亚洲的阿拉伯半岛、伊朗、阿富汗、蒙古等地区，到中国的西北部。在中国，肉苁蓉主要自然分布于内蒙古、甘肃及新疆北部[2,4]。肉苁蓉含有苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木脂素及其苷类、酚苷类、单萜苷类、生物碱类、糖类、糖醇类、甾醇类及挥发性成分等多种类型化学物质[5]。现代药理学研究表明，肉苁蓉具有提高性功能、抗衰老、抗氧化、保护肝脏、提高学习记忆、抗阿尔茨海默病及帕金森病[6]、通便等多方面的药效作用。广泛应用于现代中医临床处方、中成药和保健品，已研发上市有治疗阿尔茨海默病的中成药苁蓉总苷胶囊、复方苁蓉益智胶囊以及肉苁蓉酒和肉苁蓉茶等药品和保健品，近年来，肉苁蓉主要作为营养补充剂食用[7-11]。

随着经济发展和人民保健需求的不断增加，肉苁蓉的需求量不断上升，野生肉苁蓉的采挖量迅猛增加。由于过度开发利用，野生资源濒临枯竭，肉苁蓉及其寄主梭梭已被列为国家二级保护植物，列入《国际野生植物保护名录》[12]。国内外学者对肉苁蓉的田间接种、栽培等已做了许多研究[13-16]，但对肉苁蓉种子质量和发芽条件的研究还较少，尚未建立科学的种子质量评价标准。肉苁蓉的传统加工方法费工费时，受自然条件的影响，质量不稳定，严重影响药材的质量和利用；同时传统的加工方法已经不能满足产地大量药材初加工的需要；肉苁蓉产地加工的相关研究报道较少，既有研究主要集中在传统的趁鲜切片工艺研究方面，尚没有研究全面分析评价加工方法的优劣。因此，如何提高珍惜濒危药材肉苁蓉的利用率，综合评价初加工工艺并制定符合产地大量药材初加工的方法，以保证药材质量稳定可靠以及资源的可持续利用，是亟待解决的关键问题。

本研究以阿拉善肉苁蓉基地采集的半野生抚育种子和鲜品药材为研究对象，采用多指标综合评价方法，对肉苁蓉种子质量及鲜品初加工方法技术进行了研究。本研究结果有利于解决当前生产实践的实际问题，有利于保证药材品质，降低生产成本，提高生产效率，为人工栽培肉苁蓉提供技术参考，使肉苁蓉的加工适应于现代化生产，有着重要的社会效益和良好的经济效益。

1 材料

1.1 实验材料

肉苁蓉种子于2013年从阿拉善肉苁蓉基地收集，总计20批次，种子过0.7mm筛，实验前于4℃低温贮藏一个月。肉苁蓉鲜品药材于2013年采自阿拉善肉苁蓉基地，总计36批次，经中国医学科学院药用植物研究所黄林芳教授鉴定为列当科植物肉苁蓉C.deserticola Y.C.Ma。

1.2 仪器与试剂

日本OLYMPUS体式镜（型号：SZ2-ILST）；载玻片；智能人工气候箱（PRX多段系列，宁波海曙赛福实验仪器厂）；美国Waters高效液相色谱仪：1525 HPLC系统、Waters On-line Degasser AF型在线脱气机、Waters1525型二元泵、Waters717型自动进样器、恒温柱箱、Waters 2487双波长紫外检测器、Breeze色谱工作站。哇哈哈纯净水，超声槽（昆山超声仪器公司，型号：KQ-400DE），0.22μm有机系滤膜，抽滤仪，1mL医用注射器，高速万能粉碎机，电子天平（瑞士METTLER TOLEDO，型号：AL204-IC），电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司，型号：DGG-9070B），冷冻干燥机（上海皓庄仪器有限公司，型号：FD-A10N-50）。

氟啶酮试剂（批号：14032001）购买于上海一基实业有限公司，用丙酮配制。培养皿、滤纸均购于化学试剂与耗材商店。松果菊苷（批号：MUST-14080710）和毛蕊花糖苷（批号：MUST-14070110）对照品购买于成都曼思特生物科技有限公司，乙腈（色谱纯，美国Fisher公司），纯水（哇哈哈饮用纯净水），甲醇（分析纯，北京化工厂），甲酸（分色谱纯，北京化工厂）。

图1 阿拉善肉苁蓉半野生抚育基地肉苁蓉花期

2 种子质量评价

2.1 不同浓度质量氟啶酮对种子发芽率影响

实验玻璃器具、滤纸、蒸馏水、镊子等用高压湿热灭菌锅灭菌，在烘箱内干燥待用。超净台紫外灭菌15min待用，实验操作在超净台内完成。精确称取1.5 mg氟啶酮粉末，1-2滴丙酮溶液溶解粉末，在100mL容量瓶中定容，配制成15mg·L-1母液，稀释成所需浓度，分别为1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0mg·L-1。将肉苁蓉种子分级后，选取直径大于0.7mm的种子100粒，将种子用70%乙醇溶液浸泡2min后，2%次氯酸钠消毒20min，蒸馏水冲洗，待用。将消毒后的种子放入75mm，盛有3-5mL不同浓度氟啶酮溶液的培养皿中，每个培养皿放2层滤纸，用封口膜密封，用铝箔纸包裹，智能人工气候箱中恒温25℃下黑暗培养，30天统计发芽率。每个浓度设3个重复。

2.2 千粒重的测定

在每一批次种子中随机取1 000粒净种子，用电子天平称重，精确到0.1mg，重复3次。

2.3 种子空胚率的测定

用镊子数取每批种子各100粒，用蒸馏水浸泡24 h后，于载玻片上压出种胚，统计有胚种子与无胚种子的百分率，重复3次，凡有胚的种子为饱满种子，无胚种子为空瘪种子。

2.4 种子水分含量的测定

取肉苁蓉净种子0.1 g，置小称量瓶内，分析天平称重记录，放于105±2℃恒温烘箱烘干至恒重后称重，计算种子水分含量，重复3次。

2.5 发芽率测定

参照“2.4”项下方法操作，使用最佳质量浓度氟啶酮做预处理，对20批肉苁蓉种子做发芽率测定。

3 鲜品肉苁蓉产地初加工研究

3.1 色谱条件

采用Waters-C18色谱柱（3.9 mm×150 mm，4.6µm），以乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序为：线性梯度洗脱程序：0-10min，28%A，10-25min，28%→40%A。流速为1mL·min-1；紫外检测波长254 nm。

3.2 肉苁蓉切片样品的制备

将新鲜的12份肉苁蓉样品清洗干净，均匀切成厚度为5mm的薄片，每份样品随机分成3组（自然风干ZRC1-12，热风循环烘干HRC1-12，冷冻干燥DRC1-12），分别对每一份样品的3组做自然风干、热风循环烘干（80℃）和冷冻干燥处理，备用。

3.3 对照品和供试品溶液的制备

精密称取松果菊苷和毛蕊花糖苷对照品适量，加50%甲醇于2mL容量瓶至刻度，振摇混合均匀备用。配制成每1mL含1.20mg毛蕊花糖苷和1.34mg松果菊苷的母液，然后按照一定比例稀释成0.2mg·mL-1的对照品溶液。取经不同加工方法处理后的干燥饮片，粉碎，过3号筛。精密称取药材粉末1 g置于带瓶塞的锥形瓶中，加50%甲醇约50mL溶解，超声处理30min放置至室温，补足失重，取上清液用微孔滤膜（0.45μm）滤过，作为供试品溶液。

3.4 方法学考察

3.4.1 线性关系考察

分别精密吸取2组混合对照品液10μL进样，每一个浓度的混合标准品溶液，重复进样3次，记录各峰峰面积，取3次进样平均值。以各化合物峰积分面积为Y轴，以化合物浓度为X轴作图，得到各线性回归方程，毛蕊花糖苷的为y=14 458 767.78x-1 595.25，r=1显示在0.006 5-0.200 0mg·mL-1浓度范围内呈良好的线性关系；松果菊苷的为y=14 458 767.78x-1 595.25，r=1显示在0.006 5-0.200 0mg·mL-1浓度范围内呈良好的线性关系。

3.4.2 提取方法考察

比较了甲醇和流动相两种提取溶剂，确定以50%甲醇为提取溶剂。

3.4.3 稳定性和精密度试验

对同一样品溶液，在26 h内每隔4 h测定一次，毛蕊花糖苷和松果菊苷的RSD%分别为0.30和0.70，同时表明精密度试验合格。

3.4.4 重复性试验

精密称取同一样品粉末5份，按“3.3”项下方法制备5份溶液，以上述色谱条件测定，松果菊苷峰面积的RSD%为0.62，毛蕊花糖苷的RSD%为1.24。

3.4.5 加样回收率试验

精密称取已测得含量的样品适量，共5份，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入相应的对照品溶液，加50%甲醇补足至25mL，称定重量，按“3.3”项下方法操作，制备成5份样品溶液，按测定方法测定。以测得的峰面积计算含量及回收率，结果为平均回收率：毛蕊花糖苷98.77%（RSD%为1.80）；松果菊苷为97.00%（RSD%为1.20）。

按“3.3”项下方法操作制备不同加工方法共36个样品溶液，以色谱条件项下进行测定。

4 结果与分析

4.1 氟啶酮质量浓度对种子发芽的影响

随着氟啶酮浓度的越大，种子的发芽率呈增大趋势，氟啶酮浓度为10mg·L-1种子发芽率最高，但当浓度＞10mg·L-1时，随着浓度的增大发芽率反而减小。在整个发芽过程中，很多也存在发霉情况。详见图2。

4.2 肉苁蓉种子质量测定结果

根据表1得知本实验用20批荒漠肉苁蓉种子的千粒重在0.093 9-0.156 9 g范围内，平均值为0.121 0 g；含水量在4.9%-7.4%范围，平均值为6.2%；空胚率在13%-29%范围，平均值为20.3%；发芽率在37%-52%范围，平均值为45.05%。

4.3 种子质量分级标准的制定

以肉苁蓉种子发芽率、千粒重、空胚率和含水量4项指标进行K类中心聚类分析，最终聚类中心值见表2。

图2 培育10天的肉苁蓉种子发芽以及发霉情况

表1 肉苁蓉种子质量测定结果

表2 K类中心聚类的最终类中心值

表3 肉苁蓉种子质量分级标准

由表2可知，发芽率3个类中心值分别为50%、43%和41%；千粒重3个类中心值分别为0.126 4、 0.109 3和0.106 7；空胚率3个类中心值分别为16%、20%和25%；含水量的3个类中心值分别为6.2%、6.3%和6.2%。以肉苁蓉种子发芽率、千粒重、空胚率和含水量4项指标的聚类中心值作为肉苁蓉种子分级标准的参考值，结合生产实际和可操作性，在此基础上初步制定了肉苁蓉种子质量分级标准，即：Ⅰ级肉苁蓉种子外形应饱满，有光泽，大小均匀；Ⅱ级种子外形较饱满，略有光泽，大小较均匀，有少许瘪粒；Ⅲ级种子无光泽，大小不均匀，有部分瘪粒。详见表3。

4.4 经过3种不同加工方法得到肉苁蓉干燥品

由于我国养老地产处于初级发展阶段，未形成有序的规模，经验不足，尤其是养老地产相关的法律法规和养老服务标准等缺失或尚不完善，社会资本在运作养老地产项目时，会遭遇较大的瓶颈和障碍。

如图3所示，应用冷冻干燥法处理的样品外形较规整美观，热风循环烘干法处理的样品，外形颜色略暗，美观度较差；自然风干法处理的样品外形颜色暗，美观度较差。

图3 不同加工方法的肉苁蓉干燥切片

肉苁蓉中苯乙醇苷的含量测定及HPLC色谱图检测结果详见表4、图4。

表4 肉苁蓉中苯乙醇苷含量测定结果

5 讨论

5.1 肉苁蓉种子质量的评价及种子质量标准的建立

促进肉苁蓉种子萌发的氟啶酮最佳浓度为10mg·L-1，平均发芽率约为50%。影响种子质量的因素中随着空胚率的减小千粒重呈增大趋势。种子发芽过程中部分种子发生霉变，可能是种子消毒不彻底或实验操作过程中染菌所致。在实际生产中，应选择千粒重大、饱满度好的种子、适宜浓度的萌发刺激物、适宜的培养温度，还要注意培养过程无菌操作，以得到较高的发芽率。

图4 肉苁蓉混合对照品和样品的HPLC色谱图

种子质量包含内在和外在的指标。本研究以发芽率、千粒重、空胚率和含水量4项指标制定了肉苁蓉种子质量的分级标准。分级方法采用最低定级原则，即任何一项指标不符合规定标准都不能作为相应等级的合格种子。在分级的四项指标中，发芽率最为重要，千粒重可反映种子饱满程度和种子成熟度等。而含水量则可通过再加工如干燥等来提高质量。本分级标准中以发芽率、千粒重两个指标为主判断种子质量，空胚率、含水量次之。

5.2 新鲜肉苁蓉产地初加工研究

本研究对3种不同加工方法：自然干燥，热风循环烘干和冷冻干燥进行考察，结果表明最优加工方法为冷冻干燥法。该方法有效成分损失少、饮片外形美观、质地酥脆、干燥速度快，但缺点是加工成本高；其次是热风循环烘干法，该方法有效成分有部分损失，外形颜色略暗，质地较硬，干燥速度一般，加工成本略高；3种方法中最差的是自然风干法，有效成分大部分损失，外形颜色暗，由于含糖量高易产生霉变，粉碎处理麻烦，干燥速度慢，优点是加工成本低。中药材企业或种植基地应综合考虑社会效益、经济效益及自身实际情况选择最合适的加工方式。

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A Study on the Seed Quality and Primary Processing of the Fresh Productof Cistanche deserticola

Gu Caimei1,Liu Dewang2,Wang Zenghui1,CaiMin2,Huang Linfang1
(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,Chinese Academy ofMedical Sciences＆Peking Union MedicalCollege, Beijing 100193,China;2.SchoolofPharmacy,InnerMongolia MedicalUniversity,Huhhot010080,China)

The aim of this study was to evaluate the seed quality of C.deserticola and establish quality grading rules of seeds by detecting the impacts of different processing methods on the contents of the effective components of C. deserticola for optimizing the suitable processingmethod.The seed qualitywas judged by thousand-kernelweight,empty embryo rate and water content.The sampleswere preliminary processed by freeze-drying,natural drying and hotair circulation drying respectively,and the content of phenylethanoid glycosides was determined by HPLC-UV.The seed quality classification standard of C.deserticola was established,and the seeds were divided into three grades based on the standard.Itwas found that freeze-dryingmethod was optimum,featuring less effective component loss,beautiful appearance of herbal piece,crisp texture and fast drying.In conclusion,this study laid a foundation for the quality control of the seedsof C.deserticola with the provision ofscientific evidence for the initialprocessing of the fresh product.

Cistanchedeserticola,seed quality,germination percentage,freeze-dryingmethod,phenylethanoid glycosides

10.11842/wst.2017.02.019

R28

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-12-13

修回日期：2017-01-09

＊国家自然科学基金委面上项目(81473315)：地理格局及生态驱动揭示肉苁蓉品质生态型机理，负责人：黄林芳。

＊＊通讯作者：蔡敏，副教授，主要研究方向：天然药物研发；黄林芳，教授，主要研究方向：中药资源与质量评价研究。