紫色杆菌素在谷氨酸棒状杆菌中异源表达

孙 宏 年， 毕 昌 昊， 张 春 枝

( 1.大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034；2.中国科学院 天津工业生物技术研究所， 天津 300308 )

紫色杆菌素在谷氨酸棒状杆菌中异源表达

孙 宏 年1， 毕 昌 昊2， 张 春 枝1

( 1.大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034；2.中国科学院 天津工业生物技术研究所， 天津 300308 )

验证了以产L-色氨酸的谷氨酸棒状杆菌为底盘细胞异源表达紫色杆菌素的可行性。从天然产紫色杆菌素的Janthinobacteriumlividum获得了相关生物合成途径的结构基因vioA、vioB、vioC、vioD、vioE，并且在每个基因前面添加谷氨酸棒状杆菌的保守SD序列元件，与穿梭表达型质粒pEC-XK99E通过Golden-gate DNA装配方法构建，转化到能够产L-色氨酸CorynebacteriumglutamicumCICC 20192，实现了紫色杆菌素在谷氨酸棒状杆菌中的异源表达。通过对发酵过程中诱导时间的优化，最终90 h的摇瓶分批发酵获得了(1 243±207) mg/L紫色杆菌素，结果表明，谷氨酸棒状杆菌是异源表达紫色杆菌素的合适宿主。

紫色杆菌素；谷氨酸棒状杆菌；异源表达

0 引 言

紫色杆菌素(violacein)和脱氧紫色杆菌素(deoxyviolacein)是微生物生成的具有多种生物活性的次级代谢产物，具有抗肿瘤、抗致病菌、抗病毒、抗氧化等活性[1-2]。紫色杆菌素是以L-色氨酸为前体物质，经过在同一个操纵子上编码的酶按照vioA→vioB→vioE→vioD→vioC的酶促反应顺序催化生成，其中在没有酶vioD催化的情况下会生成脱氧紫色杆菌素[3]。目前发现了很多革兰氏阴性杆菌能够天然产生紫色杆菌素，尤其对Chromobacteriumviolaceum、Janthino-bacteriumlividum和Duganellasp.B2的研究较为深入[4-6]，但是受限于其较低的产物生成速率、前体物质不足以及致病性等因素无法进行大规模工业生产。近年来，随着代谢工程和系统微生物学的发展，研究者开始对E.coli进行遗传改造，提供更充足的L-色氨酸前体来生产紫色杆菌素[7]。谷氨酸棒状杆菌一般认为是安全的(GRAS)革兰氏阳性菌，并且已经多年来作为工业化生产L-色氨酸，本研究首次探索以其为底盘细胞，来异源生产紫色杆菌素，为紫色杆菌素的未来大规模生产提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试 剂

硫酸卡那霉素，上海生工生物工程有限公司；IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，北京索莱宝科技有限公司；质粒小量快速提取试剂盒，美国Axygen公司；DNA 回收试剂盒，美国Biomiga公司；Prime STAR HS DNA聚合酶，大连宝生物工程公司；Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker、Trans2K Plus DNA Marker，北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶BsaⅠ、DpnⅠ、EcoR V， T4 DNA连接酶，New England Biolabs公司。

1.1.2 仪 器

PCR扩增仪，Eppendorf；全自动凝胶成像系统，AlphaImager HP；UV-2550紫外可见分光光度计，Shimadzu。

1.1.3 菌株、质粒和引物

本研究所用的菌株、质粒和引物见表1。

1.2 方 法

1.2.1 培养基的配置

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，121 ℃，15 min；

BHIS培养基(g/L)：牛脑心浸粉37，D-山梨醇91，分别灭菌，使用前混合，121 ℃，15 min；

种子培养基(g/L)：葡萄糖50，酵母浸粉10，玉米浆30，硫酸铵4，七水硫酸镁0.25，磷酸二氢钾1.0，磷酸氢二钾1.0，七水硫酸亚铁0.01，硫酸锰0.01，pH 7.2，115 ℃，20 min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，玉米浆50，硫酸铵10，七水硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，磷酸氢二钾1.0，七水硫酸亚铁0.01，硫酸锰0.01，苯丙氨酸0.03，酪氨酸0.03，碳酸钙10，pH 7.2，115 ℃，20 min。

表1 实验所用菌株、质粒和引物

1.2.2 质粒的构建与转化

1.2.2.1 基因组的提取

在LB培养基中，对Janthinobacteriumlividum30 ℃培养24 h后，离心收集菌体，使用基因组提取试剂盒提取基因组，-20 ℃冷冻备用。

1.2.2.2 目的基因的扩增

谷氨酸棒状杆菌的保守SD序列为GAAAGGAGGTTT[8]，所以在表达外源基因时，在每个功能基因前面加入宿主菌的保守SD序列增强外源蛋白的表达量以提高产量。以Janthinobacteriumlividum基因组为模板，分别以vioA-F/vioA-R、vioB-F/vioB-R、vioC-F/vioC-R、vioD-F/vioD-R、vioE-F/vioE-R作为前后引物，进行PCR扩增；以pEC-XK99E为模板，pEC-F/pEC-R为前后引物进行目的片段的扩增，DpnⅠ消化过夜后对目的片度进行DNA凝胶回收。

1.2.2.3 质粒的构建与转化子的筛选

采用Golden-gate DNA装配方法[9]构建pEC-vio，将Golden-gate反应液化学转化到E.coliDH5α中，从LB培养皿上挑选紫色单菌落，过夜培养，提取质粒进行酶切和测序鉴定。

1.2.2.4 重组菌的构建

谷氨酸棒状杆菌感受态细胞的制备和电击转化参见文献[10]，从培养皿中选取紫色阳性克隆进行保藏。

1.2.3 培养条件

1.2.3.1 大肠杆菌的培养

含有表达载体的E.coliDH5α在37 ℃条件下含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB丰富培养基中摇床过夜培养。

1.2.3.2 谷氨酸棒状杆菌的发酵培养

C.glutamicumCICC 20192 pEC-vio和对照组ATCC 13032 pEC-vio的摇瓶发酵过程是：将冻存于-80 ℃冰箱的菌种在含有25 μg/mL硫酸卡那霉素的BHIS平板上划线活化，挑取单菌落接种到3 mL BHIS培养基，30 ℃、200 r/min培养48 h；以4%的接种量转接到250 mL三角瓶(25 mL种子培养基)，30 ℃、200 r/min培养24 h；以4%的接种量转接到500 mL三角瓶(25 mL发酵培养基)，30 ℃、200 r/min培养12 h，添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，同时把培养温度降为20 ℃，低温发酵72 h。

1.2.3.3 诱导时间的优化

菌种在30 ℃发酵培养基中分别培养6、12、18、24、30 h后，进行低温诱导发酵，比较紫色杆菌素产量。

1.2.4 测定方法

1.2.4.1 紫色杆菌素标准曲线的绘制

称取不同质量的紫色杆菌素粗提取物干燥粉末，配制终质量浓度为0、25、50、75、100、150、200、300 mg/L紫色杆菌素溶液，使用可见光分光光度计测定其在570 nm(1 cm光程)处的吸光度，绘制标准曲线。

1.2.4.2 发酵体系中紫色杆菌素的测定

测定方法参照文献[6]。

1.2.4.3 色氨酸的测定

CICC 20192和ATCC 13032发酵液中色氨酸的测定方法参照文献[11]。

2 结果与讨论

2.1 质粒构建和转化结果

2.1.1 质粒图谱

质粒pEC-vio的构建基于pEC-XK99E，该质粒是以通用的Ptrc为诱导型启动子，同时在每个vio基因的前面人为添加来源谷氨酸棒状杆菌的保守SD序列。质粒图谱和DNA片段扩增结果分别如图1、2所示。

图1 pEC-vio质粒图谱

2.1.2 PCR扩增目的片段结果

在图2A中，扩增的质粒骨架pEC大小为6 727 bp，位于DNA Marker 5 kb和8 kb中间，条带清晰单一，无非特异性扩增；在图2 B中，从左到右条带依次为vioA、vioB、vioC、vioD、vioE，大小分别为1 340、3 063、1 336、1 150、621 bp。

图2 DNA片段扩增结果

2.1.3 大肠杆菌转化结果与质粒酶切鉴定

将DNA片段进行Golden-gate反应后，化学转化到E.coliDH5α，图3为转化结果。图中蓝紫色菌落为阳性克隆，说明质粒已经成功转入并且生成紫色杆菌素。Ptrc作为广泛使用的诱导型的启动子，在大肠杆菌可以得到同样表达。

图3 pEC-vio在E. coli DH5α中的转化结果

pEC-vio质粒大小14 115 bp，使用Clonemanager软件进行辅助设计对质粒酶切分析，最后确定使用EcoR V将质粒限制性切割大小分别为2 025、4 333、7 757 bp，实验结果如图4所示。

2.1.4 谷氨酸棒状杆菌的电转化结果

CorynebacteriumglutamicumCICC 201 92的电转化结果如图5所示。在BHIS固体培养基中，出现的转化子刚开始是白色的小菌落，然后逐渐变紫，这应该是质粒出现了泄露表达现象[12]，过早表达了相关酶蛋白，积累了紫色杆菌素，虽然这会对微生物生长前期造成一定的代谢压力，生长速率变慢，但是更有利于筛选阳性克隆。

2.2 紫色杆菌素标准曲线

不同浓度的紫色杆菌素粗提取液x(mg/L)与相应的570 nm处的吸光度y，拟合的线性关系为y=0.004 6x+0.005 2，R2=0.998 2，说明线性关系良好。

图4 pEC-vio的酶切结果

2.3 发酵结果

2.3.1 色氨酸产量

CorynebacteriumglutamicumCICC 20192和ATCC 13032，在发酵培养基中发酵72 h，测得CICC 20192的L-色氨酸产量为163 mg/L，而野生型并未检测到色氨酸，与预测结果一致。

2.3.2 紫色杆菌素的产量

菌株ATCC 13032 pEC-vio和CICC 20192 pEC-vio的紫色杆菌素产量如图6所示，野生型的菌株并未检测到紫色杆菌素，发酵过程中也没有见到菌体任何变紫的现象；相反，CICC 20192的紫色杆菌素产量达到了(780±25) mg/L，证实了以产色氨酸的谷氨酸棒状杆菌为底盘细胞异源生产紫色杆菌素是可行的，为通过代谢工程手段生产紫色杆菌素提供了新的目标微生物。

图6 CICC 20192 pEC-vio紫色杆菌素产量

2.3.3 最适诱导时间的确定

从种子液接种到发酵培养基后，先进行30 ℃培养，以快速获得足够的生物量再进行低温诱导表达[7]，所以合适的诱导时间对紫色杆菌素的积累至关重要。如图7所示，接种后18 h进行诱导获得了最大产量，达到了(1 243±207) mg/L，诱导时间过早或过晚都对产物的积累不利。

图7 不同诱导时间的紫色杆菌素产量

3 结 论

本实验证实了以产L-色氨酸的Corynebac-teriumglutamicumCICC 20192为底盘细胞异源表达紫色杆菌素的可行性。从Janthinobacteriumlividum中分别克隆得到包含有谷氨酸棒状杆菌保守SD序列的功能基因vioA、vioB、vioC、vioD、vioE，然后与C.glutamicum/E.coli穿梭质粒PEC-XK99E通过Golden-gate DNA装配方法构建质粒，在84 h摇瓶发酵培养过程中，紫色杆菌素产量达到了(780±25) mg/L；通过对诱导时间的优化，产量进一步提高到(1 243±207) mg/L。

[1] PLATT D, AMARA S, MEHTA T, et al. Viola- cein inhibits matrix metalloproteinase mediated CXCR4 expression: potential anti-tumor effect in cancer invasion and metastasis[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2014, 455(1): 107-112.

[2] CHOI S Y, KIM S, LYUCK S, et al. High-level production of violacein by the newly isolatedDuganellaviolaceinigrastr. NI28 and its impact onStaphylococcusaureus[EB/OL]. [2015-10-22]. http: //www. nature. com/articles/srep15598.

[3] BALIBAR C J, WALSH C T.InVitrobiosynthesis of violacein from 1-Tryptophan by the enzymes VioA-E fromChromobacteriumviolaceum[J]. Biochemistry, 2006, 45(51): 15444-15457.

[4] MENDES A S, DE CARVALHO J E, DUARTE M C T, et al. Factorial design and response surface optimization of crude violacein forChromobacteriumviolaceumproduction[J]. Biotechnology Letters, 2001, 23: 1963-1969.

[5] PANTANELLA F, BERLUTTI F, PASSARIELLO C, et al. Violacein and biofilm production inJanthinobacteriumlividum[J]. Journal of Applied Microbiology, 2007, 102(4): 992-999.

[6] WANG H, JIANG P, LU Y, et al. Optimization of culture conditions for violacein production by a new strain ofDuganellasp. B2[J]. Biochemical Engineering Journal, 2009, 1(7): 119-124.

[7] RODRIGUES A L, TRACHTMANN N, BECKER J, et al. Systems metabolic engineering ofEscherichiacolifor production of the antitumor drugs violacein and deoxyviolacein[J]. Metabolic Engineering, 2013, 20: 29-41.

[8] KANG M S, HAN S S, KIM M Y, et al. High-level expression inCorynebacteriumglutamicumof nitrile hydratase fromRhodococcusrhodochrousfor acrylamide production[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(10): 4379-4387.

[9] HILLSON N J, ROSENGARTEN R D, KEASLING J D. j5 DNA assembly design automation software[J]. ACS Synthetic Biology, 2012, 1(1): 14-21.

[10] TAUCH A, KIRCHNER O, L FFLER B, et al. Efficient electrotransformation ofCorynebacteriumdiphtheriaewith a mini-replicon derived from theCorynebacteriumglutamicumplasmid pGA1[J]. Current Microbiology, 2002, 45(5): 362-367.

[11] 程立坤,徐庆阳,谢希贤,等.HPLC快速测定发酵液中L-色氨酸[J].天津科技大学学报,2010,25(1):9-12.

[12] BILLMAN-JACOBE H, HODGSON A L, LIGHTOWLERS M, et al. Expression of ovine gamma interferon inEscherichiacoliandCorynebacteriumglutamicum[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1994, 60(5): 1641-1645.

The heterologous expression of violacein inCorynebacteriumglutamicum

SUN Hongnian1, BI Changhao2, ZHANG Chunzhi1

( 1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China )

The feasibility of heterogenous expression of violacein based on the chassis of aCorynebacteriumglutamicumthat could produce L-Trp was proved. Related biosynthetic pathway genes ofvioA,vioB,vioC,vioD,vioEwere amplified from natural violacein producerJanthinobacteriumlividum, ahead of which the element of conservative SD sequences were added, and constructed withC.glutamicum/E.colipEC-XK99E by Golden-gate DNA assembly method. The heterologous expression of violacein was accomplished inCorynebacteriumglutamicum. The violacein production of (1 243±207) mg/L was obtained in the optimization induction time of shaking-flask batch fermentation for 90 h. The results indicated thatCorynebacteriumglutamicumwas an appropriate host for violacein production.

violacein;Corynebacteriumglutamicum; heterologous expression

2016-02-28.

国家高技术研究发展计划项目(2015AA020202)；天津市科技支撑计划重点项目(Y5M2121111).

孙宏年(1990-)，男，硕士研究生；通信作者：张春枝(1963-)，女，教授.

Q789

A

1674-1404(2017)02-0079-05

孙宏年,毕昌昊,张春枝.紫色杆菌素在谷氨酸棒状杆菌中异源表达[J].大连工业大学学报,2017,36(2):79-83.

SUN Hongnian, BI Changhao, ZHANG Chunzhi. The heterologous expression of violacein inCorynebacteriumglutamicum[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(2): 79-83.