补中益气颗粒对脾气虚型变应性鼻炎大鼠血清IL-5及鼻黏膜IL-5m RNA表达的影响*

刘婷 朱玲 吴飞虎

补中益气颗粒对脾气虚型变应性鼻炎大鼠血清IL-5及鼻黏膜IL-5m RNA表达的影响*

刘婷1朱玲2吴飞虎2

目的 通过观测补中益气颗粒对实验大鼠血清IL-5水平及鼻黏膜IL-5mRNA表达水平的影响，探讨其治疗脾气虚型变应性鼻炎的作用机制。方法①采用病症结合造模原理，在采用游泳力竭法、大黄法、饥饿法等多因素复合伤脾的方法造成大鼠脾气虚模型的基础上，用卵清蛋白为过敏原使大鼠致敏，建立脾气虚型变应性鼻炎大鼠模型。②以补气升阳，甘温除热的代表方药补中益气颗粒灌胃，创立脾气虚型变应性鼻炎大鼠中药组模型。③观察各模型组大鼠接受治疗后症状改变情况，用酶联免疫吸附法（ELISA）对各组血清中IL-5水平进行检测；用聚合酶链式反应(PCR)对各组鼻黏膜中IL-5 mRNA表达水平进行检测。结果与变应性鼻炎组及脾气虚型变应性鼻炎组相比，脾气虚型变应性鼻炎药物组症状改善明显，且血清IL-5水平及鼻黏膜IL-5mRNA表达水平均明显降低（P＜0.01）。结论补中益气颗粒治疗脾气虚型变应性鼻炎的作用机制之一是通过调节Th2细胞因子IL-5的表达，从而纠正Th2细胞因子的失衡状态，最终对脾气虚型变应性鼻炎产生治疗效果。

补中益气颗粒；变应性鼻炎；脾气虚；IL-5

变应性鼻炎(Allergic Rhinitis AR)是指特异性个体接触过敏原后导致包含IgE介导的炎症介质释放和多种免疫活性细胞、细胞因子参与的鼻黏膜慢性炎症性疾病，临床上称为变应性鼻炎，是临床上的常见病、多发病[1]。AR虽不至危及生命，但可不同程度地影响患者的生活质量，并可能导致其他相关疾病如哮喘、鼻窦炎、肿瘤等的发生及发展，目前已成为一个全球性的健康问题，其防治也是全球医务工作者研究的热点之一[2]。变应性鼻炎归属中医“鼻鼽”范畴，又称嚏、鼽、鼽嚏等，均以其症状进行命名。中医医家针对此病也进行了广泛深入的研究，近代中医耳鼻咽喉科创始人干祖望教授提出了“耳鼻喉科脾胃论”的观点，在临床上力荐应用补中益气汤治疗变应性鼻炎，大量临床观察亦证实补中益气汤治疗变应性鼻炎临床疗效确切，同时也证实其对AR患者Th1/Th2平衡、血清IgE、多种炎性细胞因子都有一定的调节作用[3-5]。本研究通过评价脾气虚型变应性鼻炎大鼠在应用补中益气颗粒治疗前后，血清中IL-5水平及鼻黏膜中IL-5 mRNA表达水平的变化，来探讨补中益气颗粒用以治疗脾气虚型变应性鼻炎的作用机制。

材料与方法

1 动物及分组

健康SD大鼠48只，体重200g，雌雄各半。适应性饲养2天后，随机分为正常组12只（正常-AR组）、AR组12只（1-AR组）、脾气虚模型组24只，雌雄各半。脾气虚模型组经评价造模成功后再次分为脾气虚AR组（p-AR组）、脾气虚AR中药组（药-AR组），每组12只，雌雄各半。正常组自由饮水，正常饮食。

2 造模方法的选择

2.1 1-AR组（AR组）

[6]，以卵清白蛋白O.30mg作抗原，氢氧化铝粉末30mg作佐剂，加生理盐水lml形成混悬液，腹腔内注射，隔日1次，共7次。腹腔注射完成后的第2天，行被动皮肤免疫反应试验(passivecutaneous-anaphylasis，PCA)，待确定大鼠体内OVA特异性抗体阳性后，两侧鼻腔均以5%卵白蛋白溶液10ul局部免疫，每日1次，共7次；

2.2 脾气虚模型组

采用大黄法、游泳力竭法、饥饿法多因素复合伤脾的方法，连续21天，造成脾气虚模型[7，8]。即：减少每日饲料的摄入量，每日上午8点添加饲料，下午8点撤去饲料；②每日下午于大鼠尾根部栓上铁丝，使其负重，并确保其可以沉入水中，放入水温约20℃、水深约50cm的水桶内游泳，使其力竭而不致死（大鼠鼻尖没进水中10S，），每日1次；③每日上午，以大黄冷浸液3ml/只灌服大鼠，1次/日，共21日。如大便稀溏，进食量减少，身体瘦削，拉尾排便次数增多，肛周污秽甚或脱肛，阴囊脱垂，精神倦怠，活动减少，毛发不光泽，蜷缩聚堆，眼秽增多，弓背等，则表明脾气虚模型复制成功[9]。

2.3 p-AR组（脾气虚AR组）、药-AR组（脾气虚AR中药治疗组）

在脾气虚模型组的基础上，再造AR病证结合模型组，造模方法同AR组实验动物。基础致敏成功后，将脾气虚AR组大鼠随机分为：p-AR组、药-AR组。治疗组以补中益气颗粒灌胃，大鼠用药量与人按体表面积折算等效剂量：用补中益气颗粒（吉灵参）65g×0.18×5=5.85/kg灌胃给药，每日1次，每次1ml/100g，连续用药15天。

3 药品及试剂

卵清蛋白Sigma A-5253 10G。氢氧化铝,天津市光复精细化工研究所，产品标准号：津Q/HG NK 204-2000。伊文斯蓝Sigma E-2129 1G。补中益气颗粒(成分：炙黄芪、党参、炙甘草、当归、炒白术、升麻、柴胡、陈皮、生姜、大枣)，北京汉典制药有限公司，国药准字Z20040120。大鼠IL-5 ELISA试剂盒购于雷杜公司。

4 指标观测

4.1 动物的一般情况

从实验第1天起，认真观察并记录大鼠的一般情况：如摄食、饮水、大小便情况、活动状态、精神状态，每周记录体重1次，仔细观察鼻部症状，观察喷嚏次数、抓鼻次数，是否有鼻分泌物等情况。

4.2 鼻部行为学症状观察

每次鼻腔激发后30分钟内，仔细观察并记录大鼠抓鼻动作、喷嚏次数、流涕范围等鼻部症状，计分方法选用叠加量化法。观察计分如表1。

表1 鼻部行为学症状计分

每只大鼠的行为学计分采用其7次激发得分的均数，如分数超出5分，表示AR模型造模成功。治疗组通过鼻腔激发后的行为学观察来了解经过药物干预后鼻部症状的改善情况。

4.3 PCA实验（被动皮肤免疫反应试验）用0.1ml生理盐水，对正常组进行皮内注射；用1mg卵清蛋白和1%伊文斯蓝混合液1ml，对1-AR组、p-AR组、药-AR组大鼠进行皮内注射，注射后30min后，观察注射部位有无皮肤硬结，以及染料是否扩散，记录扩散范围，直径＞10mm记做（+），5mm＜直径＜10mm记做（±），5mm以下则为（-），PCA实验结果为阳性者，说明已有OVA特异抗体存在于大鼠体内，证明致敏成功。

4.4 各组造模成功后第2天，麻醉后取主动脉血，血标本用离心机离心3000r/min,15min，移液管移取上清液，用ELISA方法测定血清中IL-5的含量。各组大鼠取血标本后处死，并将上颌骨从颅骨中游离出来，沿鼻中线剪开鼻腔，暴露鼻中隔及双侧鼻腔，留取大鼠鼻黏膜，黏膜速置于液氮中，放置-80℃冰箱保存备用，检测时应用PCR法检测待测鼻黏膜IL-5mRNA表达指标。

5 统计学分析

采用SPSS 19．0统计软件进行统计学分析，对所得数据进行管理和统计分析构成比较；对所检测的指标均进行α正态性检验α＝0.1；计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析；等级资料采用χ2检验。以P＜0.05为有差异，P＜0.01有显著差异，P＞0.05为没有统计意义。

实验结果

1 动物的一般情况

实验前，各组动物正常饮食、活动，未见打喷嚏、流清涕、搔抓鼻部等症状，AR组大鼠在鼻局部致敏第一天，初始时未见明显鼻部症状，15分钟左右时局部症状出现，随后逐渐增强，20分钟左右时症状最为明显，30分钟时症状基本消失。造模时间越久，打喷嚏、流清涕、搔抓鼻部等症状加重，且症状较初期时发作时间减短，第3～4次时，可出现典型的变应性鼻炎鼻部症状，打喷嚏、抓鼻一般都在10次以上，可出现涕流满面的症状。而AR病症结合模型组，鼻部致敏第一天，5～10分钟左右时症状便可出现，部分症状严重的大鼠1小时后症状才基本消失，造模成功后部分大鼠无鼻部刺激后仍有明显的打喷嚏、流清涕、搔抓鼻部症状。

2 检测结果

2.1 血清IL-5水平

表1 补中益气颗粒对脾气虚型变应性鼻炎大鼠血清IL-5水平的影响

2.2 鼻黏膜IL-5mRNA表达水平

从图1可以看出，正常-AR组大鼠鼻黏膜中IL-5mRNA相对表达量最低，p-AR组相对表达量最高。药-AR组大鼠鼻黏膜中IL-5mRNA相对表达量明显低于未使用药物的1-AR组及p-AR组。

图1 IL-5mRNA相对表达量

讨论

目前变应性疾病在全球范围内呈现上升趋势。AR作为耳鼻咽喉科常见病多发病,影响着全球大约5亿人的生活[10]。在我国13个省（63个市）和4个直辖市，针对508名耳鼻咽喉头颈外科医生进行的问卷调查结果显示，AR患者占全部耳鼻咽喉头颈外科门诊患者的比例平均为1/5，占全部鼻腔鼻窦疾病门诊患者的1/3[11]。大量研究显示，Th1和Th2细胞间免疫反应失衡是导致AR的免疫学基础[12]。辅助性T淋巴细胞亚群按产生细胞因子的类型和生物学的功能的不同，可以分为Th1和Th2两种类型，正常情况下，Th按一定的比例向Th1和Th2分化，两者处于相对平衡状态，维持着机体正常的细胞免疫和体液免疫功能。当机体受到异常抗原刺激时，两者间的平衡被打破，Th2亚群功能升高，而Th1亚群功能降低，即可引起异常的免疫应答[13]。在此免疫应答过程中，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等细胞因子，此类细胞因子称为Th2细胞因子[14]，AR发病过程中Th1细胞劣势表达，Th2细胞优势表达，即Th2相关细胞因子的优势表达。何迎春等[15]研究表明，AR大鼠迟发相脾组织中IL-5表达增高，且其水平与鼻黏膜嗜酸性粒细胞（EOS）数呈正相关。庞文会等[16]研究亦证实，IL-5水平与鼻黏膜组织局部的EOS数目改变也是一致的，在AR组含量明显升高。

IL-5对促进嗜酸粒细胞(EOS)成熟及延长其生存期也可产生作用。AR鼻黏膜组织中EOS的浸润与症状的严重水平密切相关,IL-5在迟发相反应中亦占据重要作用,在鼻黏膜的变态性反应迟发相中最为重要的病理改变,如EOS的浸润、分化、活化等,均通过IL-5来维持和延续,慢性变应性炎症反应主要通过抑制IL-5来控制,所以IL-5决定着AR慢性炎性反应的发展[17]。

另有研究表明，IL-5也激活了循环中的EOS，这些EOS聚集到抗原刺激部位，导致变应性鼻炎的发作,嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）则在抗原刺激后增加合成,迅速而又强大地促进EOS在局部组织中选择性募集，一旦在抗原刺激部位积聚了大量的EOS，IL-5即与其他因素一起，促使EOS延长保存并释放出一系列蛋白颗粒，从而导致AR发作[18]。由此看来，IL-5在变应性鼻炎发病以及治疗过程中发挥着极其重要的作用。

中医认为，鼻鼽是由于脏腑虚损，正气不足，腠理疏松，卫表不固，不任风寒，或禀质特异，异气侵袭所致。其病位在肺，与脾胃密切相关，而脾为后天之本，气血生化之源，“四季脾旺不受邪”[19]。李东垣曾在《脾胃论·脾胃胜衰论》中指出:“饮食入胃,先行阳道,而阳气升浮也。浮者,阳气散满皮毛,升者,充塞头顶,则九窍通利也”。鼻位于人体头面部,皆属于“清空之窍”,其功能的正常有赖于人体清阳之气的濡养,清阳既升,孔窍分泌之浊阴亦降,则清窍得养,湿浊亦可去,官窍得以正常通利。江苏省中医院耳鼻喉干祖望教授提出“耳鼻喉科脾胃论”，在临床上采用健脾补土，益气升阳之法治疗脾虚型变应性鼻炎取得较好的疗效。补中益气汤出自金代李东垣《内外伤辨惑论》，药物组成包括：黄芪、人参、白术、升麻、陈皮、炙甘草、柴胡、当归。该方为补气升阳，甘温除热的代表方。方中重用黄芪为君，味甘微温，入脾、肺经，补中益气，升阳固表。配伍人参、炙甘草、白术补气健脾为臣，与黄芪合用，以增强其补益中气之功。血为气之母，气虚时久，营血亦亏，故加当归养血和营，协人参、黄芪以补气养血；陈皮理气和胃，使诸药补而不滞，共为佐药。且以少量升麻、柴胡升阳举陷，助君药以升提下陷之中气，共为佐使。炙甘草调和诸药，亦为使药。诸药合用，使气虚得补，气陷得升则诸症自愈。气虚发热者，亦借甘温益气而除之。本次实验所采用的补中益气颗粒是通过现代制药工业的提取、纯化分离、制粒、干燥及包装5个步骤，按照传统补中益气汤的组方用药制备而来，可有效地纠正中药汤剂味苦、不易携带、熬药复杂等特点，同时其性能稳定，易于吸收、安全性高、计量准确、方便保管，更利于临床推广使用，易于被患者所接受[20]。

当代药理及大量临床研究表明补中益气汤具有调节免疫功能的作用，其中所含方药大多也具有提高免疫力的作用:人参所含的主要有效成分人参二醇皂苷及人参多糖在增强免疫方面体现优势[21]，人参皂苷具有双相免疫调节作用，能改善实验动物的非特异性免疫和特异性免疫功能[22]，周英武等[23]研究发现人参皂甙Rg1通过引起OVA小鼠混合性Th1/Th2平衡免疫反应，从而增强小鼠对卵清蛋白的特异性免疫应答；黄芪含有的黄芪多糖、黄芪皂苷、黄芪黄酮可以增强、调节机体的固有免疫及体液免疫功能[24]；白术所含白术多糖可增强机体免疫功能，促进淋巴细胞增强及抗体生成和细胞因子的分泌[25]，黄利等[26]研究发现白术水煎剂可在一定程度上增强小鼠的免疫功能；当归对多种致炎剂引起的急性毛细血管通透性增高、组织水肿及慢性损伤均有显着抑制作用[27]；在抗肿瘤、调节机体免疫系统、促进造血功能等方面有很好的药用价值[28]；柴胡多糖可促进造血干细胞向淋巴细胞分解，加强巨噬细胞吞噬能力，诱生干扰素，激活机体免疫机能[29]。

本研究表明补中益气颗粒可以显著降低脾气虚型变应性鼻炎大鼠升高的IL-5的水平，缓解并改善脾气虚型变应性鼻炎大鼠的相关症状，促进疾病的恢复。从而提示降低机体IL-5的水平可能是补中益气颗粒治疗脾气虚型变应性鼻炎的作用机制之一，但因此次实验所取指标较为单一，并不能全面诠释补中益气颗粒治疗脾气虚型变应性鼻炎的作用机理，其机制仍有待于进一步的科学研究。

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（收稿：2016-08-01 修回：2016-10-25）

The Influence of Buzhong Yiqi Particle on IL-5 and the Expression of Nasal Mucosa IL-5m RNA of rRatsw ith Sp lenic Asthenic Allergic Rhinitis

LIU Ting,ZHU Ling,WU Feihu
Department of Otorhinolaryngology;the First Affiliated Hospital of AnhuiUniversity of traditional Chinese Medicine,Anhui,230038,China

ObjectiveThrough observing the influence of Buzhong Yiqi particle on IL-5 and the expression of nasalmucosa IL-5 mRNA of rats with splenic asthenic allergic rhinitis,this paper discussed themechanisms of splenic asthenic allergic rhinitis.Methodology①With combination of disease and symptom molding theory,methods ofmulti-factor impairment of the spleen like exhaustion method by swimming,rheum officinale and starvation method were employed to produce rats spleen-deficiency models, ovalbumin was used as an allergen to sensitize the rats and splenic asthenic allergic rhinitis ratsmodels were constructed.②The representative traditional Chinese medicine of tonifying Qi and lifting yang as well as clearing heat with sweet-warm medicine-Buzhong Yiqi particle was used as the administration?by gavage to build rats models with splenic asthenic allergic rhinitis.③To observe symptom changes of each model and to test IL-5 levels with ELISA.Furthermore,PCR was used to test IL-5 mRNA expression of nasalmucosa.ResultBy comparing the group with allergic rhinitiswith thatwith splenic asthenic allergic rhinitis,the latter one had more obvious improvement of symptoms and its IL-5 and the expression of IL-5 mRNA were significantly decreased (P＜0.01).ConclusionOne of the actionmechanisms of Buzhong Yiqi particle on splenic asthenic allergic rhinitis is through adjusting the expression of Th2 cytokines IL-5 to rectify the imbalance states of Th2 cytokines so as to produce a therapeutic effect to splenic asthenic allergic rhinitis.

Buzhong Yiqiparticle;Allergic rhinitis;Splenic asthenia;IL-5

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2017.01.003

汉典凤凰中西医结合英才基金重点项目（编号：hdfh001）

1 安徽中医药大学研究生部（安徽合肥，230038）

2 安徽中医药大学第一附属医院耳鼻咽喉科

朱玲，副主任医师.Email:369699562@qq.com