奇士肽神经内分泌网络与生殖功能调控

李江源

(解放军总医院内分泌科，北京 100853)

奇士肽神经内分泌网络与生殖功能调控

李江源

(解放军总医院内分泌科，北京 100853)

十余年前奇士肽(Kisspeptin)的发现已成为人类生殖功能调控的新里程碑，更新了神经内分泌调控生殖功能的认识。奇士肽神经元联动兴奋性神经激肽B和抑制性强啡肽神经元形成KNDy网络，从上游调控GnRH的脉冲分泌和下丘脑-垂体-性腺轴功能。KNDy神经元应答性激素的负反馈和正反馈信号、介导青春期启动和在下丘脑神经内分泌网络反映身体能量代谢状态方面起关键性作用。

奇士肽； 神经内分泌网络； 调控； 生殖功能

(JReprodMed2017，26(2)：99-105)

人类的生殖功能始于下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的脉冲式释放引起的青春期发育，GnRH刺激垂体前叶促性腺激素(LH和FSH)的脉冲分泌，依次促进性腺的发育和配子(精子或卵子)生成，同时合成和分泌性激素(睾酮或雌激素和孕酮)。性激素一方面辅助配子生成，另一方面反馈调控GnRH/LH，FSH的分泌，以维持下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)功能的平衡和正常的生殖功能。早年的研究已发现下丘脑GnRH神经元既无雌激素受体(ERα)，也无雄激素受体(AR)，因而在GnRH神经元的上游必定还有介导性激素反馈调控的神经内分泌网络。近10余年来奇士肽的发现及其生理功能的研究，增进了对HPG轴功能调控的了解。奇士肽是下丘脑KiSS1基因编码的肽类激素，与下丘脑分泌的神经激肽B(NKB)和强啡肽(DYN)共同组成KNDy神经内分泌网络，调控GnRH的脉冲式释放。

一、奇士肽的发现

1999年，Lee等[1]在比较转移性黑色素瘤细胞(C8161)和非转移性黑色素瘤细胞(neo6/C8161)cDNA时，分离出一个新的基因，由于是在美国宾夕法尼亚Hershey城发现的，当地以kisses巧克力闻名于世，新基因被命名为KiSS1。KiSS1 mRNA只在非转移黑色素瘤细胞表达，将KiSS1 cDNA转染至转移性C8161黑色素瘤细胞可以抑制肿瘤细胞的转移。因而KiSS1当时被定义为转移抑制基因，称为“metastin”。KiSS1基因定位于常染色体1q32，含4个外显子，编码一个145个氨基酸(AA)的前体肽(prepro-kisspeptin)，前体肽中的54个AA多肽(KP-54)是奇士肽的功能部分，KP-54可进一步被裂解为KP-14，KP-13和KP-10，其C-端具有相同的Arg-Phe-NH2主体结构，并都有激活G蛋白偶联受体54(GPR54)的功能[2]。GPR54是1999年首先在大鼠的脑组织克隆的一个孤儿受体，2年后发现在人大脑、垂体和胎盘有表达，并证明其配体是奇士肽，又称为KiSS1R[3]。2003年de Roux等[4]报告一个近亲婚配家系，8个子女中，4例男性和1例女性均为先天性低促性腺激素性性腺功能减退症(HH)，基因测序显示GPR54第4和第5外显子有大段缺失，首次揭示了KiSS1/KiSS1R有调控下丘脑GnRH分泌的功能。动物实验进一步证明，GPR54基因敲除小鼠性腺发育不良，促性腺激素和性激素水平降低；而GPR54突变转基因小鼠无青春期发育，促性腺激素和性激素水平低下[5]。

二、奇士肽神经内分泌网络

在小鼠下丘脑弓状核(ARC)，约92%的KiSS1神经元表达DYN，在第III脑室前腹侧室周核(AVPV)的KiSS1神经元33%表达DYN。ERα基因敲除(KO)小鼠切除卵巢(OVX)后，ARC区的DYN mRNA表达增多，皮下植入E2则表达下降约80%。ARC的KiSS1神经元约20%表达DYN受体(KOR)mRNA，受体表达水平低可能与探针的设计有关，E2抑制KOR的表达。在OVX小鼠ARC，约90%的KiSS1神经元表达NKB mRNA，96%表达NKB受体(NK3R)，而在AVPV区NKB mRNA的表达只有10%，E2抑制二者的表达。OVX.DYNKO小鼠和OVX.KORKO小鼠的血清LH水平分别只有野生型小鼠水平的37%和53%。此外，OVX小鼠给予KOR或NK3R激动剂显著抑制血清LH水平[6]。Burke等[7]发现大鼠ARC内KNDy神经元的轴突形成轴突丛，并进入正中隆突(ME)，轴突中含有奇士肽、NKB和DYN三种肽。以上实验结果证明下丘脑GnRH神经元上游存在一个应答性激素反馈作用的KNDy神经内分泌网络。大鼠的奇士肽神经元主要分布于ARC和AVPV，少数分布在视前区(POA)。大鼠AVPV区的奇士肽神经元有性别二态性，雌鼠神经元数量多，雄鼠少。新生雄鼠去势后AVPV区的奇士肽神经元的数量增多，因而性别二态性的原因是新生儿期暴露于雄激素，这一现象称为雄性个体的去女性化，去女性化现象反映两性奇士肽对性激素反馈调控的反应不同，ARC没有性别二态性[7]。

人尸检下丘脑标本免疫组化研究发现，奇士肽神经元主要位于漏斗核(相当于大鼠的弓状核)，在第III脑室腹侧形成室周细胞团(大细胞室周核)，轴突形成室周丛，它们的数量女性多于男性，存在性别二态性。奇士肽神经元与GnRH神经元形成轴突-细胞团、轴突-树突和轴突-轴突之间的连接。双免疫标记染色发现奇士肽神经元77%合成NKB，56%的奇士肽纤维NKB免疫反应阳性[8]。绝经后妇女漏斗核的奇士肽和NKB细胞体增大，奇士肽细胞数量、纤维密度以及与GnRH神经元的连接增多。反映了雌激素对奇士肽的负反馈调控作用，一旦外周雌激素缺失，奇士肽神经元的反应增强，促性腺激素水平增高[9]。

三、奇士肽对GnRH分泌的调控

OVX小鼠ARC中的KiSS1表达增强，E2替代治疗后恢复正常状态；而AVPV相反，OVX使KiSS1表达减少，E2替代治疗后增加。ERαKO雌性小鼠在OVX和E2替代治疗后，ARC和AVPV都没有KiSS1 mRNA表达；而敲除ERβ，E2对KiSS1的表达效应不受影响。双标记原位杂交研究发现，ARC和AVPV都表达ERα。奇士肽拮抗剂注入ARC可终止大鼠的GnRH脉冲分泌，而注入POA核则没有这种作用[10]。将抗奇士肽抗体注入雌性大鼠的AVPV，可以阻滞排卵前LH分泌大波的发生，对LH脉冲频率和幅度没有显著影响；而注入ARC，则抑制LH脉冲分泌的幅度，而对LH分泌大波没有影响；提示ARC的KiSS1神经元是E2负反馈调控GnRH释放的中枢；而AVPV则是正反馈调控中枢[11]。雄性小鼠去势和睾酮替代治疗后，ARC和AVPV的KiSS1 mRNA表达模式与雌性小鼠完全相同，而不被芳香化酶转化的二氢睾酮对KiSS1 mRNA表达的效能则显著低于睾酮，说明雄性个体睾酮的反馈调控作用主要是通过芳香化酶转化为E2实现的[12]。

母羊OVX后1 d，LH脉冲数增加2倍，平均LH浓度增加3倍；30 d后脉冲数增加至4倍，平均LH浓度增加9倍。动情间期OVX母羊静脉注射人KP-10，剂量≥6 nmol/h可升高血浆LH和FSH水平；在繁殖季节给母羊静脉注射鼠KP-10，12.4 nmol/h连续输注30～48 h可使80%的母羊出现排卵前的LH分泌大波和排卵[13]。母羊下丘脑的免疫组化研究发现，奇士肽神经元大多数分布于ARC，少数位于POA，与黄体期和卵泡期比较，排卵前ARC和POA的奇士肽神经元数量均显著增多。说明母羊平时的E2负反馈调控中枢在ARC，排卵前LH分泌大波的正反馈调控中枢在ARC和POA[14]。OVX母羊ARC的GnRH神经元突触囊泡蛋白阳性末梢与奇士肽细胞胞体有连接，在ARC植入KiSS1R拮抗剂P271后1～2 h，LH脉冲分泌被抑制，脉冲间期延长，脉冲幅度降低；植入NK3R拮抗剂SB222200，LH脉冲间期延长，脉冲幅度降低；而植入NKB后，LH脉冲间期缩短，脉冲幅度无变化[15]。

有规律月经的妇女在月经后4～6 d服用NK3R拮抗剂(AZD4901)40 mg/d，5 d后加用E2皮贴200 μg/d，血清LH水平被抑制；停用E2皮贴48 h，LH水平回升；如果在应用E2皮贴48 h后静脉输注KP-10，剂量4 μg/kg/h，连续7 h，血清LH水平在静脉输注期间持续升高。提示人类与其它哺乳动物一样，存在奇士肽神经内分泌网络，NKB参与了E2对GnRH的负反馈调控[16]。健康成年妇女接受8 h皮下连续输注KP-54，在8 h输注期间每10 min采血一次，分析LH、FSH和E2水平。KP-54的输注剂量分别为0.1、0.3和1.0 nmol/kg/h，8 h输注总剂量分别为0.85、2.55和8.5 nmol/kg。随着KP-54剂量的增加，LH脉冲数亦相应增加，但没有统计学意义，原因可能与例数太少(n=4)有关；LH脉冲幅度没有显著的组间差异。回归分析发现，基线E2水平每升高100 pmol/L，平均LH分泌的相关系数在0.1 nmol/kg/h组为-1.75，0.3组为+0.83，而1.0组为+1.0，说明基线E2水平越高，LH对KP-54的反应水平亦越高，反映了E2的正反馈作用[17]。

5例健康成年男子分别参与8次试验：(1)8 h-LH脉冲分析，每10 min采血一次；(2)(1)+LH脉冲分析前口服纳曲酮(NAL)50 mg；(3)(1)+连续输注KP-54 0.1 nmol/kg/h；(4)(1)+连续输注NKB 2.56 nmol/kg/h；(5)(1)+(2)+(4)；(6)(2)+(3)；(7)(3)+(4)；(8)(2)+(3)+(4)，每次试验至少间隔7 d。结果显示，输注KP-54各组[(3)、(6)、(7)和(8)]的LH脉冲数和(或)幅度显著升高，(2)组LH脉冲数增加，幅度无明显变化，(4)组LH脉冲数和幅度都无明显变化；近似无序分析(ApEn)显示，输注KP-54各组有序脉冲增多，而(2)组和(4)组无序脉冲增多；提示GnRH脉冲分泌的调控是一个复杂的过程，是KNDy神经元中各组分协调作用的结果[18]。

现在的证据表明，GnRH神经元的上游存在一个以奇士肽神经元为核心的神经内分泌网络KNDy，其功能是调控GnRH的脉冲分泌[19]。

四、奇士肽与青春期发育

正常雌性大鼠性成熟年龄为(34.8±0.35)d。给25 d龄雌性大鼠侧脑室内置管，次日开始向管内滴注KP-10，每12 h输入1 nmol/10 μL，不间断连续输注6 d，雌鼠阴道张开(青春期性成熟标志)，子宫和卵巢重量增加3倍，血清LH水平升高10倍，E2水平升高2倍，证明奇士肽启动了青春期发育[20]。奇士肽脉冲式分泌是奇士肽-NKB-DYN相互作用的结果，NKB的兴奋作用和DYN的抑制作用形成“启动-终止”的间歇性分泌模式，传入GnRH神经元即启动了GnRH的脉冲式释放。通过分析ME的KP-54脉冲分泌发现，雌性恒河猴在青春期前KP-54的脉冲频率缓慢，脉冲间期约为80 min，到了青春期，KP-54的脉冲频率加快，脉冲间期约为50 min，这一规律与是否切除卵巢无关。说明KP-54的脉冲分泌不依赖于E2的调控，在KNDy的上游可能还有调控信号[21]。

人类婴儿在1～3个月时有一个促性腺激素分泌小高峰，其程度低于青春期发育，称为“小青春期”(minipuberty)。此后，进入一个长达数年的静默期，直至青春期启动。在静默期起抑制作用比较重要的因子是γ-氨基丁酸(GABA)，青春期雌猴ME的奇士肽/GnRH浓度升高，GABA水平降低；在第III脑室底部间歇注入GABA受体拮抗剂bicuculline，可诱导青春期前雌猴完成青春期发育，出现月经和排卵。谷氨酸类似物(NMDA)间歇性激活谷氨酸受体与激活奇士肽释放的效果相同，可引起去势幼年雄猴发生性早熟[22]。神经肽Y(NPY)在去势雄猴从出生到青春期的表达是由强变弱。但是，NPY对青春期启动是否有“制动器”(brake)作用还有待进一步研究证明。现在的假设认为，青春期启动的调控有两个“开关”，一是在少年期“关掉”GnRH脉冲发生器，使下丘脑处于低促性腺激素状态；二是在少年期发育结束时，重新“打开”GnRH脉冲发生器，启动青春期发育过程。少年期身体发育的代谢和内分泌信号传入大脑的“身体监测器”(somatometer)，然后通过与GnRH脉冲发生器相关的神经内分泌网络启动青春期发育，“身体监测器”在大脑的定位和功能网络还有待阐明[22-23]。

在人类，已有例证证明KISS1/KISS1R获得功能性突变可以引起性早熟，而丧失功能性突变可导致无青春期发育。2008年Teles等[24]报告一例中枢性性早熟女孩，出生时即有乳房发育，到7岁生长速度一直较快，骨龄达到11岁，GnRH兴奋试验LH反应峰值达到青春期水平，基因测序发现是KiSS1R基因发生了获得功能性杂合子突变(Arg 386 Pro)[25]。Silveira等[26]报告一例1岁男孩发生中枢性性早熟，血清LH和睾酮水平显著升高，基因分析为KiSS1基因Pro 74 Ser突变。家族成员中，患儿母亲和外祖父亦带有相同的基因突变，但是，没有发生性早熟。韩国检查143例中枢性性早熟女孩，KISS1基因测序发现9个单核苷酸多态性(SNPs)。与正常女孩比较，性早熟女孩出现频率较高的SNPs包括55648184C/G [OR1.567(95%CI：1.091-2.252)]和55648186-/T[OR1.458(95%CI：1.015-2.095)][27]。但是，KISS1基因SNPs与中枢性性早熟是否有因果关系还需要进一步研究。另一方面，KISS1/KISS1R丧失功能性突变则可导致先天性HH，无青春期发育。Topaloglu等[28]报告一个土耳其库尔德人大家庭，14个孩子中，4个女孩年龄12～30岁无青春期发育，为嗅觉正常的先天性HH，血清LH 0.2 U/L，过夜LH脉冲分析无LH脉冲出现，KISS1基因测序为 Asp 115 Lys 纯合子突变，父母和另外4个女孩为杂合子突变，有正常青春期发育。KISS1R基因突变自2003年首次报告以来，已有20余例病例报告。突变形式包括缺失、移码、点突变和复合性杂合子突变。临床表现从完全性到部分性促性腺激素缺乏，即使是相同突变基因型的患者临床表现也不尽相同。一个家系5例女性患者均为KISS1R 115碱基对纯合子缺失，只有1例患者表现性发育不全，乳房小，有过一次月经来潮，100 μg GnRH兴奋试验血清LH水平从2.0 U/L上升至11.8 U/L，FSH从3.4 U/L上升至6.4 U/L[29]。但是，也有报告两例男性患者KISS1R点突变Gua259Glu和Asp120Cys引起重度先天性HH，除了无青春期发育外，还有男子乳房发育、嗅觉缺失、唇裂、颚裂和牙齿发育不良[30]。

TAC3和TACR3基因分别编码NKB及其受体NK3R，二者丧失功能性突变可诱发先天性HH。根据603例嗅觉正常先天性HH患者的筛查，TAC3突变的患病率为1%，TACR3为2.6%[31]。TAC3/TACR3丧失功能性突变的女性患者表现无乳房发育和月经来潮，幼稚型子宫和卵巢；男性患者小睾丸和小阴茎，无第二性征发育；血清性激素和LH水平低，FSH水平相对正常；GnRH兴奋试验LH无反应，FSH呈弱或正常反应；LH脉冲分析无脉冲分泌[31]。已有TAC3突变HH患者成年期发生自然逆转的病例报告[32]。

五、奇士肽与能量代谢

摄食和能量代谢平衡是生物维持生命的必备条件，也是获得身体发育和生殖功能的基础。营养不良如饥饿、长期激烈运动、神经性厌食、糖尿病和病态性肥胖可导致青春期发育延迟或性腺功能减退。能量的主要储存部位是脂肪，脂肪细胞分泌的瘦素(leptin，LEP)抑制食欲，减少进食，血清LEP水平反映了体脂量和能量代谢状态。其他调控能量代谢的因子还有胰岛素和胃促生长素(ghreline)，都有促进食欲的作用[33]。

围青春期雌性恒河猴喂食高热量食料后，身高、体重和体脂量以及血清LEP、LH和FSH水平都显著高于对照组，月经初潮提早约4个月，证明摄入高热量食物可使血清LEP水平增高和青春期启动时间提前[34]。反之，营养不良会抑制HPG轴功能。成年雄猴在禁食48 h后，血浆LEP和葡萄糖水平降低，下丘脑Kiss1和Kiss1r mRNA表达显著减少[35]。KISS1神经元只表达少量瘦素受体(LEPR)，提示接受LEP信号的中枢不是奇士肽神经元，而是另有所属。下丘脑ARC表达阿片促黑激素皮质素原(preopiomelanocortin，POMC)，POMC的主要产物是alpha-黑素细胞刺激激素(a-MSH)，其受体MC3R和MC4R分布于下丘脑和其他脑区。POMC接受身体的代谢信号，包括LEP、胰岛素和胃促生长素，调控HPG轴功能[36]。幼年大鼠脑室内注射MC3/4R激动剂MT-II，血清LH水平无明显变化，而青春期大鼠在注射后LH水平在30 min内升高2～3倍；禁食48 h后LH水平下降，MT-II可使LH水平回升。长期摄入低热量食料，大鼠的体重、子宫和卵巢重量以及血清LH水平都降低，阴道张开延迟，脑室内注射LEP可以逆转营养不良的这种影响。免疫组织化学研究发现，青春期雌鼠ARC中的alpha-MSH纤维与奇士肽神经元有直接连接，脑室内注射MC3/4R拮抗剂SHU9119可抑制ARC内KISS1 mRNA表达。以上实验提示LEP/LEPR的信号通道是alpha-MSH-KISS1-GnRH[37]。丧失功能性LEP基因突变小鼠(ob/ob)和LEPR基因突变小鼠(db/db)除了肥胖和糖尿病倾向外，还有性腺功能减退和其他方面的不良影响[38]。人类LEP基因丧失功能性突变至今已有20余例报告，男女两性均有累及，患者儿童期即出现多食肥胖，血清LEP水平显著降低(<2.0 ng/ml)，无青春期发育，临床表现为非失嗅性先天性HH，家系分析为常染色体隐性遗传。重组人瘦素(r-metHuLeptin)长期替代治疗可以恢复正常体重、第二性征发育、促性腺激素和性激素水平升高至正常范围以及月经来潮[39]。在16个肥胖儿童家系中，7个家系有LEPR基因突变[40]。

男性2型糖尿病患者血清游离睾酮(FT)、LH和FSH水平降低，LH和FSH对GnRH兴奋试验的反应正常，这种成年起病的HH与糖化血红蛋白水平(血糖控制程度)和糖尿病病程无关，影像学检查下丘脑-垂体没有发现病变[41]。在398例2型糖尿病和1 451例非糖尿病肥胖男性患者(年龄>45岁)中，血清FT水平降低(<0.17 nmol/L)者糖尿病组为51%，非糖尿病组为31%，在年龄和BMI调整后前者为45%，后者为33%。血清FT水平降低的患病率非糖尿病组体重正常者(BMI<25 kg/m2)为26%，超重者(BMI 25～29.9 kg/m2)为29%，肥胖者(BMI≥30 kg/m2)为40%；而糖尿病组上述三种体重指数中FT水平降低者分别为44%、44%和50%(P<0.001)[42]。美国内分泌学会指南推荐2型糖尿病男性患者常规检测血清睾酮水平，睾酮水平降低者建议给予睾酮替代治疗[43]。男性糖尿病患者发生继发性睾丸功能减退的原因未明，有人推测与胰岛素抵抗、炎症因子或雌激素水平增高有关。一项研究发现，体外培养的人GnRH细胞FNC-B4，在高浓度葡萄糖(22 mmol/L)或特高浓度葡萄糖(40 mmol/L)环境下，抑制KISS1R mRNA表达，特高浓度亦抑制KISS1 mRNA表达，这一现象与渗透压无关。定量免疫组织化学研究出现相似的结果，提示高血糖对KISS1/GnRH神经网络有抑制作用[44]。

前段已述及，无论是否罹患糖尿病，肥胖男子的血清睾酮水平都显著降低，称为肥胖相关性性腺功能减退。有人报告149例肥胖(BMI>30 kg/m2)男子，年龄18～66岁，以FT<225 pmol/L、LH<9.0 U/L和无其他垂体前叶激素水平异常为HH的诊断标准，结果总睾酮(TT)<11 nmol/L者占57.7%、生物可利用睾酮<5.2 nmol/L者占40.3%和FT<225 pmol/L者占35.6%。在FT<225 pmol/L的患者中，BMI 30～35 kg/m2为7.4%、BMI 35～40 kg/m2为21.0%、BMI 40～45 kg/m2为42.4%、BMI 45～50 kg/m2为58.3%和BMI>50 kg/m2为59.2%。说明肥胖相关HH随肥胖程度的增高而增高，如果BMI>40 kg/m2，超过40%的肥胖男子罹患HH[45]。年龄14～20岁，青春期发育在Tanner 4期或以上的青少年男子，肥胖者(BMI≥95th百分位)与非肥胖者(BMI<85th百分位)比较，TT(nmol/L)为10.5 vs.21.4、FT(nmol/L)为0.22 vs.0.39、LH(U/L)为(2.9±1.6) vs.(3.5±1.5)、总E2和游离E2水平肥胖组亦显著低于非肥胖组(P<0.01)，进一步证明肥胖可以导致睾酮水平降低，致病原因与雌激素无关[46]。但是，也有研究发现，重度肥胖男子的血清雌激素水平比非肥胖男子高2倍，认为是脂肪组织芳香化酶活性增强所致，芳香化酶抑制剂来曲唑治疗可使血清睾酮水平恢复正常[47]。可能肥胖相关HH的致病原因不是单一因素。此外，肥胖男子的精液质量下降，包括精子形态、精子浓度和精子活动力，可能是由于促性腺激素水平降低和阴囊脂肪沉积引起的局部温度升高所致[48]。

六、结语

奇士肽的发现及其调控GnRH脉冲分泌的作用的证据是生殖内分泌领域的一个里程碑性进展，更新了性激素对下丘脑反馈调控、青春期启动以及能量代谢与生殖功能关系的认识。随着奇士肽及其激动剂和拮抗剂研究的深入，包括青春期延迟、性早熟、诱导排卵、多囊卵巢综合征、下丘脑性闭经和神经性厌食在内的一些疾病将会开辟新的疗法，推动临床诊断和治疗的进步[49]。

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[编辑：罗宏志]

Kisspeptin neuroendocrine network and regulation of reproductive function

LIJiang-yuan

DepartmentofEndocrinology，GeneralHoapitalofPLA，Beijing100853

The discovery of kisspeptin became a new milestone in the regulation of human reproduction more than a decade ago，and it updated awareness of the neuroendocrine regulation of reproductive function.Kisspeptin neurons which synchronize with stimulatory signal from neurokinin B and inhibitory signal from dynorphin neurons to form the KNDy network have been identified to act upstream of GnRH neurons to control GnRH pulsatile secretion and the function of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis.KNDy neurons response to both negative and positive feedback signals of sex steroids and mediate the onset of puberty，which plays a pivotal role in connection between hypothalamic neuroendocrine network and energy metabolism of the body.

Kisspeptin； Nneuroendocrine network； Regulation； Reproductive function

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.02.001 ·专家论坛·

2016-11-13

李江源，男，广东电白县人，主任医师，教授，内分泌学专业.