利拉鲁肽对大鼠2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝内质网应激的影响研究

朱红霞，邓晓龙，高静，李晓岚，王伟，王敏哲，陈军辉

（1.新疆医科大学第五附属医院，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第六附属医院，新疆乌鲁木齐 830002）

·实验研究·

利拉鲁肽对大鼠2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝内质网应激的影响研究

朱红霞1，邓晓龙1，高静1，李晓岚1，王伟1，王敏哲1，陈军辉2

（1.新疆医科大学第五附属医院，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第六附属医院，新疆乌鲁木齐 830002）

目的探讨利拉鲁肽对2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪肝组织内质网应激（ERS）的影响。方法将健康雄性8周龄SD大鼠随机分为正常对照组（NC组，n＝10）、单纯高脂高糖喂养组（MC组，n＝9）、利拉鲁肽低剂量治疗组（GLP－L组，n＝10）和利拉鲁肽大剂量治疗组（GLP－H组，n＝8）。NC组喂常规饲料，MC组喂高脂高糖饲料，GLP－L组和GLP－H组自第9周起分别经皮下注射利拉鲁肽0.4 mg／kg和0.8 mg／kg。检测各组大鼠的血浆生化指标，并常规石蜡包埋切片，观察大鼠肝脏脂肪变性；采用实时荧光定量PCR方法检测肝脏组织固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）、内质网甘露糖苷酶样蛋白1（EDEMI）和载脂蛋白B100（apoB100）mRNA表达。结果MC组大鼠血浆空腹血糖（FBG）和空腹胰岛素（FINS）水平均较NC组、GLP－L组和GLP－H组显著升高（P＜0.05），且MC组血浆总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）、游离脂肪酸（FFAs）和胰岛素抵抗指数（HOMA－IR）水平均较NC组、GLP－L组和GLP－H组明显升高（P＜0.05），而HDL－C水平则较上述3组显著降低（P＜0.05）。GLP－H组血浆FBG及FINS水平较GLP－L组显著降低（P＜0.05）；与NC组比较，MC组、GLP－L组和GLP－H组大鼠肝组织SREBP1，EDEMI mRNA表达均显著升高（P＜0.05），apoB100 mRNA表达均下降（P＜0.05），GLP－L组和GLP－H组SREBP1，EDEMI mRNA表达明显低于MC组大鼠（P＜0.05），apoB100 mRNA表达高于MC组，且GLP－H组SREBP1 mRNA表达均显著低于GLP－L组（P＜0.05）。结论ERS参与了肝脏内游离脂肪酸诱导的细胞脂肪变性过程，利拉鲁肽可能通过缓解T2DM模型大鼠肝脏组织内质网应激的激活，从而改善脂质代谢紊乱。

利拉鲁肽；2型糖尿病；非酒精性脂肪肝；内质网应激

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）在全球的发病率不断升高，亚洲地区尤为显著。研究显示，中国患有糖尿病的成年人多达9 240万，糖尿病前期患者1.428亿，居世界首位[1]，合并非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者7 000万左右。T2DM及NAFLD的发生与高血脂、胰岛素抵抗、肥胖有关，胰岛素抵抗、血脂异常、肥胖等相互作用引起体内脂质代谢紊乱，过多脂类沉积于肝脏，引起脂肪肝发生。内质网应激（ERS）是一种由于外界环境刺激而导致的错误折叠与未折叠蛋白质在内质网腔内聚集，以及Ca2＋平衡紊乱的状态[2]。研究表明，ERS在T2DM及脂肪肝的形成过程中具有重要作用[3]。胰高糖素样肽－1（GLP－1）是由胃肠道L细胞和胰岛细胞分泌的一种内源性多肽[4]。利拉鲁肽（liraglutide）是一种人源性的GLP－1受体激动剂，与GLP－1有97%的同源性，目前已应用于临床糖尿病的治疗。本研究中基于以上发病机制，通过高脂高糖饮食加注射小剂量链脲佐菌素（STZ）制备T2DM合并NAFLD动物模型，分别给予不同剂量的利拉鲁肽腹腔注射，观察肝脏组织结构变化，以明确ERS是否参与了游离脂肪酸(FFAs)诱导的细胞脂肪变性形成过程，并探讨利拉鲁肽对ERS的潜在影响，以及对早期防治糖尿病合并NAFLD的重要意义。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物建模与分组

健康雄性8周龄SD大鼠（上海西普尔－必凯实验动物有限公司，动物实验许可证号为SY2012－0048），体质量为180～200 g；饲养条件为自由饮水、进食，室温（20.0±2.5）℃。将大鼠适应性喂养后进行编号，随机分为正常对照组（NC组，n＝10）和T2DM合并NAFLD模型组（n＝30）。NC组常规饲料，模型组高脂高糖饲料（基础饲料82%，猪油10%，胆固醇2.5%，胆酸钠0.5%，蔗糖5%）。第4周末，参照传统方法建立T2DM模型[5]，隔夜空腹经腹腔注射链脲佐菌素（STZ，30 mg／kg）一次破坏部分胰岛，NC组同法注射相应体积的生理盐水。注射STZ 4周后，检测血糖和胰岛素，当连续2次以上出现空腹血糖(FBG)≥7.8 mmol／L，视为建立T2DM模型成功。

结果27只大鼠建模成功，简称T2DM大鼠。将T2DM大鼠随机分为单纯高脂高糖喂养组（MC组，n＝9），利拉鲁肽低剂量组（GLP－L组，n＝10）和大剂量组（GLP－H组，n＝8）。自第9周起，GLP－L组和GLP－H组分别经皮下注射利拉鲁肽注射液(丹麦诺和诺德公司，国药准字J20160037，规格为每支3 mL∶18 mg)。取1 mL利拉鲁肽用注射用水稀释10倍后，再取上述溶液用注射用水稀释10倍后，得0.06 g／L利拉鲁肽。分别予利拉鲁肽0.4 mg／kg和0.8 mg／kg，1次／日，共注射8周；MC组给予腹腔注射等体积生理盐水。本实验经院内动物实验伦理委员会批准同意。

1.2 观察指标检测

血浆生化指标：空腹血糖（FBG）采用葡萄糖氧化酶法（One Touch血糖仪及血糖试纸购自强生医疗器材有限公司）；空腹胰岛素（FINS）检测采用放射免疫法，三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）、FFAs检测采用酶法，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，按试剂盒说明书进行相关操作并计算。胰岛素抵抗指数（HOMA－IR）＝FBG×空腹胰岛素／22.5。

肝脏脂肪变性：取大鼠肝脏最大叶距边缘5 mm处肝组织，40 g／L甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片。油红O染色后，显微镜下（Leica公司IX71图像系统）观察肝细胞中脂质形成情况，评估脂肪变性程度。评估标准，按照肝小叶内含脂滴细胞数／总细胞数比值，0为（－），＜1／3为（＋），1／3～2／3为（＋＋），＞2／3为（＋＋＋）；分别将肝细胞脂肪变性分为无、轻度、中度、重度。

肝脏组织ERS相关基因mRNA表达测定：取肝组织100 g匀浆并提取总RNA后，以紫外分光光度计（Bio－Rad公司）测定其浓度，取1 μg总RNA，逆转录合成cDNA，应用DNAstar 6.0版软件，根据GenBank大鼠脂代谢相关靶基因载脂蛋白B100（apoB100）、固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）和内质网甘露糖苷酶样蛋白1（EDEMI）mRNA序列，设计PCR引物，见表1。选择最适条件分别对靶基因和内参基因B－肌动蛋白（β－actin）进行PCR扩增，PCR产物进行2.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描分析系统拍照，并分析电泳条带灰度值，以靶基因与β－actin电泳条带密度比值计算各靶基因mRNA相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 血浆糖代谢和生化学指标

结果见表2。MC组大鼠血浆FBG和FINS水平均较NC组、GLP－L组和GLP－H组显著升高（P＜0.05）；MC组血浆TC，TG，LDL－C，FFAs和HOMA－IR水平均较NC组、GLP－L组和GLP－H组明显升高（P＜0.05），而HDL－C水平则较上述3组显著降低（P＜0.05）。GLP－H组血浆FBG和FINS水平较GLP－L组显著降低（P＜0.05）。

表2 大鼠血浆糖代谢和生化学指标比较（±s）

表2 大鼠血浆糖代谢和生化学指标比较（±s）

注：与NC组比较，aP＜0.05；与MC组比较，bP＜0.05；与GLP－L组比较，cP＜0.05。下表同。

项目FBG(mmol／L) FINS( mol／L) TC(mmol／L) TG(mmol／L) HDL－C(mmol／L) LDL－C(mmol／L) FFAs(mmol／L) HOMA－IR NC组(n＝10) 5.48±0.38 406.14±27.84 1.26±0.35 0.45±0.13 4.72±0.69 1.11±0.25 1.62±0.32 1.85±0.41 MC组(n＝9) 9.25±0.86a491.95±35.47a1.91±0.25a0.72±0.19a3.51±0.49a1.92±0.41a2.58±0.47a3.83±0.82aGLP－L组(n＝10) 6.84±0.72ab451.09±29.62ab1.52±0.32b0.53±0.16b4.02±0.31a1.30±0.37b1.94±0.36b2.34±0.71bGLP－H组(n＝8) 5.92±0.64bc418.40±31.96bc1.30±0.24b0.48±0.15b4.52±0.73b1.26±0.41b1.70±0.32b1.96±0.61bF值／P值57.975／0.000 13.916／0.000 9.101／0.000 5.352／0.004 8.186／0.000 8.985／0.000 12.490／0.000 17.695／0.000

2.2 肝脏组织病理学变化

大鼠肝组织内存在的脂滴能被油红O染料染成红色，染红脂滴的数量多少及分布面积存在差异。NC组大鼠肝组织细胞排列整齐，偶见染红的脂肪细胞。MC组大鼠可见明显染红区域，肝组织内脂滴含量多，弥漫、大小不等，大量大泡样脂滴分布在腺泡集中区域，部分脂滴出现融合现象。GLP－L组和GLP－H组可见染红区域面积及程度均较MC组减少，颜色变浅，多以小脂滴存在，且GLP－H组较少，程度更显著，肝细胞排列较整齐（见图1）。

图1 各组小鼠脂肪变性程度

可见，MC组、GLP－L组和GLP－H组大鼠肝细胞脂肪变性程度均高于NC组（P＜0.05），GLP－L组和GLP－H组大鼠和MC组比较，肝细胞脂肪变性程度下降（P＜0.05），GLP－H组大鼠与GLP－L组比较，肝细胞脂肪变性程度也有所下降（P＜0.05）。详见表3。

表3 4组大鼠肝脏细胞脂肪变性情况(只)

2.3 肝脏组织ERS 相关基因mRNA 表达特征

结果见表4。与NC组比较，MC组、GLP－L组和GLP－H组大鼠肝组织SREBP1，EDEMI mRNA表达均显著升高（P＜0.05），apoB100 mRNA表达均下降（P＜0.05），GLP－L组和GLP－H组SREBP1，EDEMI mRNA表达明显低于MC组大鼠（P＜0.05），apoB100 mRNA表达高于MC组，且GLP－H组SREBP1 mRNA表达均显著高于GLP－L组（P＜0.05）。

3 讨论

内质网是一个膜性细胞器，是蛋白质合成与翻译后修饰，多肽链正确折叠与装配的重要场所，也是细胞的Ca2＋贮存器。多种因素如缺血－再灌注、低氧、缺乏生长因子、钙失衡、自由基、乙醇、药物、病毒感染、氧化应激、代谢障碍、突变基因表达的结构异常，使蛋白在内质网堆积等导致内质网功能紊乱，都会引起未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网腔内集聚，从而诱发未折叠蛋白反应，产生ERS[6－7]。ERS已被证实参与多种疾病的分子机制，包括肥胖和T2DM，而后两者均为NAFLD的高危因素。

表4 4组大鼠3组大鼠肝脏组织SREBP1，EDEMI mRNA，apoB100 mRNA表达值比较

SREBP1是肝内最重要的调控脂肪酸从头合成的转录因子[8]。其作为一种ERS蛋白与肝脂质代谢紊乱有密切关系，可引起与TC／TG合成和摄取相关基因表达的增加，导致肝细胞内TC和脂肪酸的集聚。ERS在apoB100的合成和分泌过程中也具有重要的调节作用。apoB100是肝脏合成和分泌富含TG的极低密度脂蛋白(VLDL)所必需的载脂蛋白，VLDL形成于肝脏，能转运输出肝脏合成的TG，apoB100影响和制约着肝细胞合成和分泌VLDL，引起肝脏脂质积累[9－10]。EDEMI是属于糖苷酶47家族且亚细胞定位于内质网的一种Ⅱ型跨膜蛋白[11]。当内质网功能发生紊乱导致错误折叠蛋白或无功能蛋白在腔内的大量蓄积时，启动内质网相关糖蛋白降解（GERAD）途径，促进ERS时产生的不完全折叠或错误折叠蛋白在内质网中降解[12－13]，从而维持了内质网内环境稳态平衡和正常生理功能的执行。毛刘峰等[14]的研究结果显示，18周龄高脂饮食T2DM小鼠肝脏EDEMI mRNA表达增加，apoB100基因表达量降低，表明T2DM小鼠脂肪肝的形成过程中存在肝脏内质网相关性降解增强，并导致apoB100合成和分泌的减少，加速脂肪肝形成。

利拉鲁肽为长效人GLP－1类似物，可刺激内源性胰岛素释放，同时降低食欲、减慢胃排空；能显著降低FBG及餐后血糖、TG及游离脂肪酸水平[15－16]。由表2和表3可见，利拉鲁肽对T2DM模型大鼠的血糖、血脂水平均有降低作用，且对大鼠的肝脏功能、肝细胞脂肪变性均有防护作用，并呈现一定的剂量反应关系。由表4可见，MC组、GLP－L组和GLP－H组大鼠肝组织SREBP1、EDEMI mRNA表达均较NC组显著升高，apoB100 mRNA表达均较NC组下降，GLP－L组和GLP－H组SREBP1、EDEMI mRNA表达明显低于MC组大鼠（P＜0.05），apoB100 mRNA表达高于MC组，且GLP－H组SREBP1 mRNA表达均显著低于GLP－L组，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示高脂高糖诱导的T2DM模型可显著激活大鼠脂肪组织内质网应激信号通路，利拉鲁肽对T2DM模型大鼠肝脏组织ERS的激活有显著的缓解作用。

综上所述，ERS参与了肝脏内游离脂肪酸诱导的细胞脂肪变性的过程，利拉鲁肽可能通过缓解T2DM模型大鼠肝脏组织内质网应激的激活，从而改善脂质代谢紊乱，延缓NAFLD发病的进程，对T2DM合并NAFLD的防治起到一定的作用。

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Effects of Liraglutide on Endoplasmic Reticulum Stress in Mice with T2DM and Fatty Livers

Zhu Hongxia1,Deng Xiaolong1,Gao Jing1,Li Xiaolan1,Wang Wei1,Wang Minzhe1,Chen Junhui2

(1.The Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Wulumuqi,Xinjiang,China830011;2.The Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Wulumuqi,Xinjiang,China830002)

Objective To investigate the effects of liraglutide on endoplasmic reticulum stress(ERS)in mouse with T2DM and fatty livers.MethodsSD mice of 8 weeks were subdivided into four groups:the first group was given regular diet(NC group,n＝10),the second group received high fat and sugar diet(MC group,n＝9),the third group was given high fat and sugar diet and low dose of liraglutide (GLP－L,n＝10)and the forth group was given high fat and sugar diet and high dose of liraglutide(GLP－L,n＝8).The rats in GLP－L group and GLP－H group were given 0.4 mg／kg and 0.8 mg／kg of liraglutide by subcutaneous injection from the 9th week.The mRNA expression of genes(SREBP1,EDEMI and apoB100)were measured by quantitative real－time PCR.ResultsFat metabolism(FBG)and fasting plasma insulin(FINS)in MC group were significantly higher than those in NC,GLP－L and GLP－H group,and Plasma total cholesterol(TC),triglyceride(TG),high－density lipoprotein(HDL－C),free fatty acids(FFAs)and HOMA－IR in MC group were also significantly higher than those in MC,GLP－L and GLP－H group(P＜0.05).However,Low density lipoprotein (HDL－C)in MC group was lower than that in NC,GLP－L and GLP－H group(P＜0.05).FBG and FINS in GLP－H group were significantly lower than those in GLP－L(P＜0.05);compared with NC group,the expression of SREBP1,EDEMI and apoB100 mRNA were higher significantly up－regulated(P＜0.05),but the above indicators in GLP－L and GLP－H group were obviously lower than those in MC group(P＜0.05),additionally,the expression of SREBP1 in GLP－H group were significantly lower than that in GLP－L (P＜0.05).ConclusionERS plays a central role in development of liver steatosis,but liraglutide may reduce the activation of ERS in T2DM mouse then slow the process of NAFLD incidence.

liraglutide;type 2 diabetes mellitus;non－alcoholic fatty liver disease;endoplasmic reticulum stress

R965；R977.1＋5

A

1006－4931(2017)01－0006－04

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.01.002

2016－07－13；

2016－09－28)

新疆维吾尔自治区自然科学基金[015211C182]。

朱红霞（1974－），女，硕士研究生，主治医师，研究方向为内分泌与代谢疾病，（电子信箱）2780019047＠qq.com。

王敏哲，男，硕士研究生，主任医师，研究方向为内分泌与代谢疾病，（电子信箱）wangminzhe2008＠186.com。